冷冻膨胀显微镜突破硅藻细胞成像壁垒揭示超微结构多样性及生态互作新机制

《Current Biology》：Diatom ultrastructural diversity across controlled and natural environments

本研究针对硅藻因硅质细胞壁阻碍传统显微成像的技术瓶颈，开发了冷冻固定结合超微结构膨胀显微镜(cryo-ExM)新方法，成功实现了对实验室培养和野外采集硅藻细胞器的高分辨率三维成像。研究揭示了不同硅藻物种间期微管组织的保守性特征，发现了各物种独特的光合作用机器架构，并首次在环境样本中观察到硅藻与细菌的精确空间互作关系，为硅藻细胞生物学和生态学研究提供了突破性技术平台。

　　

在浩瀚的海洋中，有一类被称为"海洋草原"的微小生物——硅藻，它们虽然个体微小，却承载着地球20%的初级生产力，是海洋食物链的基础。这些单细胞藻类拥有精美的玻璃状硅质外壳，这一特征既让它们成为自然界中最美丽的微生物之一，也成为了科学家研究其细胞结构的巨大障碍。由于硅质细胞壁对大多数染料和抗体的不可渗透性，硅藻在细胞生物学研究中的应用逐渐被其他更易操作的模式生物所取代，尽管它们在生态系统中扮演着不可或缺的角色。

近年来，随着显微成像技术的飞速发展，膨胀显微镜(Expansion Microscopy, ExM)的出现为细胞生物学研究带来了革命性的变化。这种技术通过将生物样本嵌入可膨胀的水凝胶中，使其物理尺寸扩大数倍，从而在普通光学显微镜下实现纳米级分辨率。然而，对于拥有坚固硅质细胞壁的硅藻而言，传统的膨胀显微镜方法仍然难以奏效。

在这项发表于《Current Biology》的研究中，Flori等人创新性地将冷冻固定技术与超微结构膨胀显微镜(Ultrastructural Expansion Microscopy, U-ExM)相结合，建立了冷冻膨胀显微镜(cryo-ExM)技术，成功克服了硅藻细胞壁的穿透难题。研究人员通过对来自实验室培养和自然环境（包括欧洲TREC考察期间采集的样本）的多种硅藻物种进行系统研究，揭示了这一技术在硅藻细胞生物学研究中的巨大潜力。

研究团队采用的主要技术方法包括：冷冻固定技术通过快速 plunge freezing 实现样本玻璃化；超微结构膨胀显微镜处理流程包含单体渗透、凝胶聚合、变性处理和抗体标记等关键步骤；使用NHS酯作为通用超微结构标记物，结合针对微管蛋白（tubulin）和光系统II（PSII）的特异性抗体进行多色标记；应用共聚焦显微镜进行高分辨率三维成像，并通过专业软件进行图像分析和三维重构。

冷冻膨胀显微镜实现多样硅藻的稳健免疫荧光分析

研究人员首先验证了cryo-ExM在硅藻中的适用性，证明该方法能够在进化历史跨越8000万年的多种硅藻物种中实现约4倍的稳定膨胀。通过对Coscinodiscus granii和Chaetoceros neogracilis的精确测量，研究人员获得了4.3倍和4.1倍的膨胀因子，与先前在其他系统中报道的结果一致。这种高膨胀倍数使得在普通共聚焦显微镜下能够清晰分辨细胞内的精细结构。

研究团队成功将cryo-ExM应用于包括羽纹纲（pennate）和中心纲（centric）在内的多种硅藻物种，涵盖了Pleurosigma sp.、Cylindrotheca sp.、Odontella sinensis、Rhizosolenia setigera和Chaetoceros neogracilis等重要代表性物种。特别值得注意的是，该方法在TREC考察期间采集的环境样本中也表现出色，成功保存了硅藻与环境中其他微生物的相互作用关系。

系统研究自由循环硅藻物种的微管组织

通过对不同细胞周期阶段的硅藻进行系统成像，研究人员揭示了硅藻微管组织的动态变化规律。在间期细胞中，微管从位于细胞核一侧的微管组织中心(Microtubule Organizing Center, MTOC)呈放射状发出，延伸至细胞边缘。这种组织模式在不同对称性的硅藻中（辐射对称的中心纲和两侧对称的羽纹纲）都表现出惊人的保守性。

在Chaetoceros decipiens的细胞周期研究中，研究人员观察到从间期到早前期，MTOC从单个发展为两个的动态过程。细胞分裂后，两个MTOC定位于分裂面附近，随后逐渐移向子细胞中心。这一观察结果为了解硅藻细胞分裂过程中细胞骨架的重组提供了重要线索。

硅藻物种内外叶绿体和蛋白核架构的可塑性

研究团队对硅藻光合作用机器的核心组件——叶绿体和蛋白核进行了详细的形态学分析。研究发现，不同硅藻物种的光合作用机器架构具有显著的物种特异性。Coscinodiscus granii拥有多个椭圆形叶绿体和四面体状蛋白核；环境来源的Chaetoceros sp.则具有四个复杂裂片状叶绿体和扁平矩形蛋白核；而Chaetoceros neogracilis则表现为单个圆形叶绿体和带有尖端的球形蛋白核。

通过表面/体积比的定量分析，研究人员发现不同硅藻物种的蛋白核形态虽然各异，但其叶绿体占比（蛋白核/叶绿体体积比）保持相对稳定，在5.9%至11.7%之间波动。这一发现提示不同硅藻可能通过不同的结构策略来实现相似的光合作用效率。

特别引人注目的是，研究团队成功观察到了蛋白核穿透类囊体(Pyrenoid-Penetrating Thylakoids, PPTs)的精细结构。在C. neogracilis中，PPTs呈现环形排列，而在C. granii中则呈三角形排列。这些结构与透射电镜观察结果高度一致，验证了cryo-ExM在细胞器超微结构研究中的可靠性。

研究结论与讨论

本研究建立的cryo-ExM技术平台为硅藻细胞生物学研究带来了突破性进展。该技术不仅克服了硅质细胞壁对传统显微成像的限制，还实现了对实验室培养和环境样本的统一处理，为比较细胞生物学研究提供了标准化平台。

研究结果揭示了硅藻细胞骨架组织的基本原则，发现了不同物种在间期微管组织上的保守性特征，同时也展示了各物种在光合作用机器架构上的独特适应性。这些发现为了解硅藻在漫长进化过程中形成的多样化生存策略提供了细胞学基础。

特别值得关注的是，cryo-ExM技术能够完好保存自然环境中的细胞-细胞相互作用，为研究硅藻在自然生态系统中的生态互作提供了前所未有的空间分辨率。观察到的硅藻与细菌的特定空间分布模式，以及硅藻与鞭毛虫的紧密关联，为理解海洋微生物网络的构建原则提供了新的视角。

从技术发展的角度来看，这项研究为硅藻细胞生物学研究开辟了新的道路。随着该技术的推广应用，研究人员可以进一步开发针对硅藻特异性蛋白的抗体，研究硅藻细胞壁形成、营养摄取、环境适应等关键生物学过程的分子机制。特别是在全球气候变化背景下，理解硅藻细胞适应性机制对于预测海洋生态系统响应具有重要意义。

这项研究重新将硅藻确立为细胞生物学研究的重要模式系统，搭建了细胞生物学与生态学研究的桥梁，为在细胞水平理解地球上最成功的光合生物之一提供了新的技术平台和科学见解。