靶向人碳酸酐酶IV的AAV工程化改造增强基因递送至大脑

《Cell Reports》：AAVs targeting human carbonic anhydrase IV enhance gene delivery to the brain

本刊推荐：为解决天然AAV血清型经静脉给药后脑部转导效率低、跨物种翻译困难等问题，研究人员开展了靶向人血脑屏障转胞吞受体CA-IV的AAV工程化研究。通过混合体外/体内筛选管道，成功鉴定出AAV-hCA4-IV68和AAV-hCA4-IV77两种变体，在"人源化"小鼠模型中实现较AAV9提高100倍的脑转导效率，且具有神经元和星形胶质细胞广谱覆盖能力，为神经疾病基因治疗提供了转化潜力突出的新型递送工具。

　　

当我们谈论基因治疗时，腺相关病毒（AAV）无疑是当下最耀眼的明星。这种非致病性病毒载体因其卓越的安全性表现，已成为基因治疗的首选"运载工具"。目前已有五款基于天然AAV血清型的基因疗法获得FDA批准，其中用于治疗脊髓性肌萎缩症的Zolgensma（采用AAV9血清型）更是让人们看到了基因疗法攻克神经系统疾病的希望。然而，光辉背后隐藏着严峻挑战——血脑屏障（BBB）这道坚固的"城墙"严重限制了治疗药物进入大脑的效率。

血脑屏障由紧密连接的内皮细胞组成，如同精密的安全检查系统，严格控制着物质进出大脑的通道。天然AAV血清型虽然能够一定程度穿过血脑屏障，但效率低下，往往需要高剂量系统给药才能达到治疗效果，这不仅增加了安全风险，也限制了其在许多神经系统疾病中的应用。更令人困扰的是，不同物种间受体的差异使得在动物模型中筛选出的高效AAV变体，在人类应用中常常"水土不服"。例如，在小鼠中表现出色的AAV变体9P31和9P36，因其依赖的CA-IV受体在人类和小鼠间仅有55%的氨基酸同源性，导致其在灵长类动物中效果大打折扣。

面对这一挑战，来自加州理工学院的研究团队独辟蹊径，将目光投向了一种新兴的血脑屏障转胞吞受体——碳酸酐酶IV（CA-IV）。与传统的转铁蛋白受体（TfR1）等广泛表达的受体不同，CA-IV在脑内皮细胞中特异性高表达，且分布较为集中，这为精准靶向大脑提供了独特优势。Changfan Lin、Xinhong Chen等研究人员在《Cell Reports》上报道了他们如何通过巧妙的工程化策略，成功开发出靶向人CA-IV的高效AAV变体，为神经疾病基因治疗开辟了新途径。

关键技术方法包括：基于AAV9三维尖峰结构的随机肽库构建、受体特异性体外筛选（柱上pull-down和细胞转导筛选）、表面等离子共振（SPR）验证互作亲和力、"人源化"小鼠模型（通过AAV-BR1介导的脑内皮特异性人CA-IV表达）体内验证、以及人脑类器官评估跨物种转导效率。研究纳入了C57BL/6J、DBA/2J、NOD/ShiLtJ等多种小鼠品系，人脑组织单细胞转录组数据来自公共数据库（GTEx），人皮质脑类器官由人胚胎干细胞分化获得。

研究团队首先建立了可靠的体外筛选管道。他们在AAV9的VR-VIII区域插入随机七肽，构建了多样化的AAV变体库。通过柱上pull-down筛选，他们成功验证了这一方法对已知受体-AAV互作对（如PHP.eB与LY6A、9P31与小鼠CA-IV）的特异性识别能力。随后，他们将这一策略应用于人CA-IV靶向AAV的筛选，从理论上10^8规模的库中快速缩小到前0.01%（约10,000个变体）。

有趣的是，当研究人员对体外筛选排名前列的变体（Alpha 48、49、62）进行体内验证时，发现尽管这些变体在体外表现出强劲的人CA-IV依赖性转导，但在"人源化"小鼠脑中却效果平平。这一出乎意料的结果促使团队调整策略，转而采用混合筛选管道——在首轮体外筛选后，直接对前0.01%的候选变体进行体内筛选。

第二轮体内筛选带来了突破性发现。AAV-hCA4-IV68和AAV-hCA4-IV77这两个在体外筛选中排名并不靠前的变体，在"人源化"小鼠模型中表现出卓越的脑转导能力。特别是IV77，在"人源化"小鼠脑中实现了较AAV9提高100倍的转导效率，而在对照小鼠中几乎检测不到信号，显示出对人CA-IV的高度特异性。

进一步表征显示，IV68和IV77在"人源化"小鼠的大脑中实现了广泛的神经元（20%-40%）和星形胶质细胞（15%-45%）转导，覆盖皮层、腹侧中脑、丘脑等多个脑区。生物分布分析表明，这两种变体在"人源化"小鼠脑中表达水平分别达到小鼠内参基因GAPDH的40%和60%，且转导效率与组织中的人CA-IV表达水平呈正相关。

机制探索发现了一个有趣现象：IV77可通过SPR检测到与人CA-IV的互作，而IV68尽管体内表现优异，却未能检测到明显的结合信号。研究人员推测，IV68可能通过微弱/瞬时的CA-IV互作，在体内环境下通过多价接触或辅助因子作用被放大，从而实现高效转胞吞。

在人脑类器官实验中，IV77展现出比AAV9提高约2倍的转导效率，且对成熟神经元（NeuN+）具有更好的靶向性，而IV68表现与AAV9相当。这表明除了CA-IV介导的机制外，IV77可能还通过调节AAV9的天然受体来增强其转导能力。

研究结论与讨论部分强调了这一工作的多重意义。首先，研究证实了混合体外/体内筛选管道在工程化人类优化AAV中的价值，避免了完全依赖体外筛选可能遗漏高效体内载体的风险。其次，CA-IV相较于TfR1等传统受体，具有更局限的表达模式，为减少脱靶效应提供了优势。最重要的是，这一策略直接针对人类受体进行工程化，有效规避了跨物种翻译的障碍。

研究人员也指出了研究的局限性，包括"人源化"小鼠模型与人类在受体表达水平上的潜在差异，以及CA-IV酶活性可能受AAV结合影响等问题。然而，口服碳酸酐酶抑制剂在临床中的良好安全性记录提示，即使存在酶活性抑制，也可能不会成为临床应用的主要障碍。

这项研究不仅为神经疾病基因治疗提供了具有转化潜力的新型递送工具，更建立了一套针对人类受体的AAV工程化范式。通过将快速的体外工程化与"人源化"体内筛选相结合，研究人员成功突破了传统定向进化方法的物种限制，为未来开发更具靶向性、安全性的基因治疗载体指明了方向。随着对血脑屏障转胞吞机制理解的不断深入，像CA-IV这样具有独特优势的受体将为精准医疗时代的大脑靶向治疗开启新的可能。