CD9抗体增强γδT细胞抗成人B急性淋巴细胞白血病疗效的作用机制与治疗策略

《iScience》：CD9 antibody enhances the anti-leukemia efficacy of γδT cells in adult B cell acute lymphoblastic leukemia

本研究针对成人B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)复发难治问题，通过单细胞RNA测序发现CD9高表达的前B细胞簇(preB_CD9)与疾病复发密切相关。研究人员开展CD9抗体联合γδT细胞免疫治疗研究，证实抗CD9单抗可显著增强γδT细胞对CD9高表达白血病细胞的杀伤作用，为复发B-ALL提供了新的治疗策略。

　　

在血液系统恶性肿瘤中，B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)是儿童和成人中最常见的白血病亚型。虽然传统化疗显著改善了儿童B-ALL的临床结局，但成人患者的治疗效果仍不理想。约半数成人B-ALL患者无法达到完全分子学缓解或在短暂缓解后复发，复发患者的5年总生存率仅为10%。面对这一严峻挑战，深入研究B-ALL复发机制并开发新的治疗策略迫在眉睫。

肿瘤微环境(TME)在癌症发病机制中起着关键作用，显著影响肿瘤发展、进展和治疗反应。在复发B-ALL患者中，T细胞常表现更严重的耗竭状态，人白细胞抗原(HLA)-I表达下调。免疫逃避由免疫抑制性TME驱动，是白血病进展的关键因素。因此，理解免疫细胞与白血病细胞之间的相互作用可能为治疗策略的开发铺平道路。

为了阐明成人B-ALL进展过程中的转录组变化，研究人员对来自本中心的3例复发B-ALL患者、3例新诊断患者和4名健康志愿者的外周血单核细胞或骨髓单核细胞进行了单细胞RNA测序(scRNA-seq)。通过这一前沿技术，研究者成功揭示了B-ALL疾病进展中细胞簇的异质性变化，为理解疾病机制提供了新的视角。

研究人员主要运用了单细胞RNA测序技术分析临床样本，通过CellChat算法进行细胞间通讯分析，采用Monocle2进行伪时间轨迹分析，利用流式细胞术评估细胞表型和功能，建立异种移植模型进行体内疗效验证，并通过RT-qPCR和Western blot进行分子水平验证。样本来源包括本中心的B-ALL患者外周血和骨髓样本以及健康志愿者对照。

scRNA-seq profiling revealed cell cluster heterogeneity in B-ALL disease progression

通过单细胞RNA测序分析，研究人员将10个样本的细胞分为17个细胞簇，其中包括五个B细胞簇：proB、preB_ADGRF1、preB_CD9、preB_IKZF2和成熟B细胞。与健康志愿者相比，B-ALL患者的proB、preB_ADGRF1、preB_CD9和preB_IKZF2簇占主导地位，而免疫细胞显著减少。InferCNV分析显示四个B细胞簇具有明显的染色体拷贝数变异模式，支持它们被归类为白血病群体。特别值得注意的是，preB_CD9簇在复发组中显著上调，且该簇中53.5%的细胞处于S期，表明其具有活跃的增殖状态。

Cell-cell communication reveals enhanced leukemic interactions and immunosuppressive microenvironment in RE adult B-ALL

细胞通讯分析显示，复发组与初诊组之间存在显著差异。与肿瘤细胞增殖和转移相关的信号通路，如ephrin B和A、laminin和granulin precursor，在复发组中大多上调。相反，与抗原呈递和T细胞活化相关的通路则下调。preB_CD9簇在复发状态下表现出最强的信号通路激活，其与其它白血病细胞簇的相互作用显著增强，而与免疫细胞亚群的通讯明显减弱，表明复发B-ALL存在免疫抑制性TME。

Temporal heterogeneity trajectories of B cells during disease development

伪时间轨迹分析揭示了B细胞在B-ALL发展过程中的动态变化。preB_CD9细胞主要出现在复发组，位于分支2末端的命运5，表明该亚群在B-ALL进展中起关键作用。成熟B和preB_CD9簇沿分支2经历两个状态的转变，提示CD9可能反映B细胞在B-ALL发展过程中的成熟水平。

CD9 as an independent prognostic risk factor in adult patients with B-ALL

通过RT-qPCR验证，发现CD9表达在复发患者中显著上调。基于GSE34941数据集的生存分析显示，CD9高表达组的总生存期显著差于中、低表达组。多变量Cox回归分析确定CD9高表达是成人B-ALL的独立不良预后因素，风险比为3.448。

scRNA-seq revealed immunological heterogeneity in the TME during disease progression

免疫微环境分析发现，复发B-ALL患者中γδT细胞比例显著降低，CD8⁺ CTL_1和CD8⁺ TEM_1细胞是主要的免疫细胞簇。细胞毒性评分显示，γδT细胞的杀伤功能在B-ALL进展过程中受到抑制。值得注意的是，免疫细胞的衰老或耗竭表型在复发组和初诊组之间无显著差异，表明细胞毒性功能下降是免疫逃避的主要机制。

γδT cell therapy is a promising adoptive cell immunotherapy

研究发现复发组白血病细胞的HLA-I评分显著降低，提示依赖HLA-I分子的CD8⁺ T细胞免疫疗法效果有限。同时，preB_CD9簇中γδT细胞特异性靶抗原基因表达评分最高，而内源性γδT细胞的细胞毒性能力受损，表明外源性补充γδT细胞可能是治疗复发B-ALL的潜在方法。

Overexpression of CD9 strengthened the tumor lysis ability of γδT cells

通过在CD9低表达的REH细胞系中过表达CD9，研究人员发现CD9过表达显著上调了γδT细胞特异性靶抗原基因的表达，包括CD1d、ULBP1-3、ULBP5、HSPA1A、HSPA1B、HSPA8、HSPD1和MVD。抗CD9单抗处理增强了γδT细胞对CD9过表达REH细胞的凋亡诱导作用，且免疫治疗联合抗CD9单抗显著增强了γδT细胞介导的B-ALL细胞裂解。

γδT cells combined with anti-CD9 monoclonal antibody immunotherapy exhibited anti-leukemia effects both in vitro and in vivo

体外细胞毒性实验显示，γδT细胞比CD3⁺ T细胞表现出更强的抗白血病活性，而抗CD9单抗进一步增强了T细胞，特别是γδT细胞的抗肿瘤活性。在B-ALL细胞源性异种移植模型中，γδT细胞联合抗CD9单抗能更有效地控制B-ALL肿瘤负荷，提高小鼠的总体生存率。

本研究通过单细胞RNA测序技术揭示了成人B-ALL进展过程中的特征性细胞簇变化，特别是发现CD9高表达的前B细胞簇在复发患者中显著增加。同时，研究观察到免疫抑制性肿瘤微环境，主要表现为γδT细胞比例减少和抗肿瘤免疫细胞功能受损。CD9被确定为成人B-ALL的潜在预后标志物，其过表达可上调γδT细胞靶向抗原基因，增强γδT细胞的肿瘤裂解活性。更重要的是，γδT细胞免疫治疗联合抗CD9单抗能有效杀伤CD9高表达的白血病细胞。

这些发现不仅深化了我们对B-ALL复发机制的理解，更重要的是为复发难治性成人B-ALL提供了新的治疗策略。将CD9纳入诊断标志物组合可能提高对成人B-ALL复发风险的识别能力，而CD9靶向治疗联合过继性γδT细胞免疫治疗的应用有望改善复发成人B-ALL患者的预后。该研究为B-ALL的精准免疫治疗开辟了新途径，具有重要的临床转化价值。