综述：将生物源DNA转化为生物技术

本综述系统探讨了大规模获取、修饰与纯化生物源DNA（如噬菌体、质粒和基因组DNA）以替代传统固相寡核苷酸合成（SPOS）和滚环扩增（RCA）的策略，旨在克服其在大规模应用中的成本与复杂性瓶颈，推动功能DNA材料在生物技术领域的工业化与转化应用。

　　

DNA技术正在飞速发展，功能DNA基材料的应用规模日益扩大。然而，在毫克规模以上生产化学修饰的DNA仍然极其昂贵、充满挑战且研究相对不足，这严重限制了其在工业和转化领域的应用。这篇综述重点介绍了在材料和生物技术相关规模下，获取、修饰和纯化DNA的新兴策略。

Highlights

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  固相寡核苷酸合成（SPOS）和滚环扩增（RCA）能够提供精确的序列定义和修饰，但其成本和废物产生量高，降低了在克规模以上应用的实用性。
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  生物源DNA，如噬菌体DNA、质粒DNA和基因组DNA，提供了可扩展且低成本的替代方案，但需要在序列控制、纯度和分散度方面做出权衡。
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  双链DNA（dsDNA）的合成后修饰面临着反应位点有限、反应条件苛刻以及高浓度下粘度问题等挑战。

Abstract

DNA技术正在迅速扩展，最近的进展将功能性DNA基材料推向更大规模。然而，超越毫克规模的化学修饰DNA的生产仍然非常昂贵、具有挑战性且相对未被探索，限制了工业和转化用途。这篇综述文章重点介绍了在材料和生物技术相关规模下，获取、修饰和纯化DNA的新兴策略。我们比较了生物源DNA（例如，噬菌体、质粒和基因组DNA）与传统合成方法，并研究了它们的权衡。关键的是，我们重新审视了近期和经典的文献，以确定在相关规模上修饰生物源核酸的实用化学和酶促反应。最后，我们讨论了可扩展的纯化和表征方法，以支持高通量工作流程，从而在下一代应用中更广泛地使用生物源dsDNA。

DNA来源的权衡：合成与生物提取

当前，大规模获取DNA主要有两大路径：化学合成与生物提取。固相寡核苷酸合成（SPOS）是合成定制序列的金标准，尤其适用于引入非天然碱基和化学修饰，但其过程涉及大量溶剂和试剂的消耗，成本随长度和规模急剧上升，在克级以上规模显得不切实际。滚环扩增（RCA）虽然能高效生产长链单链DNA，但在精确序列控制和产物均一性方面存在局限。

相比之下，从生物体中提取DNA（生物源DNA）展现出巨大的规模化潜力。例如，噬菌体（如M13、λ、T4）可以发酵生产，提供毫克至克级的长链、单分散性良好的双链DNA（dsDNA）。质粒DNA通过大肠杆菌发酵已能实现千克级生产，是基因治疗和疫苗领域的成熟技术。基因组DNA则可以从各种生物体（如鲑鱼精子、小牛胸腺）中大量获得，成本极低，但序列是随机的，且纯度挑战较大。每种生物源都有其权衡：噬菌体DNA序列特定但宿主范围有限；质粒DNA可定制但需要克隆和发酵设施；基因组DNA成本最低但序列不可控且杂质多。

大规模DNA修饰的化学与酶法策略

获得生物源dsDNA后，如何对其进行特异性的化学修饰是将其“转化”为功能材料的关键。这面临着三重挑战：dsDNA本身反应位点有限（主要是暴露的氨基）；反应条件必须温和以维持DNA完整性；高浓度DNA溶液的高粘度会阻碍反应物混合。

可行的化学修饰策略包括：

1. 1.
   intercalation：平面芳香分子可插入DNA碱基对之间，常用于染色或作为功能基团的锚定点。
2. 2.
   小沟结合：某些分子可选择性地结合在DNA双螺旋的小沟中。
3. 3.
   磷酸骨架修饰：通过亚磷酰胺化学或酶法（如激酶、连接酶）对磷酸基团进行修饰。
4. 4.
   碱基修饰：针对特定碱基（如鸟嘌呤的N⁷位、胞嘧啶的N⁴位）进行烷基化或连接功能基团。例如，甲基化、炔基化等。

酶法修饰提供了高特异性和温和的反应条件。聚合酶能够将修饰过的核苷酸掺入DNA链中。连接酶可用于将功能化寡核苷酸“缝合”到DNA片段上。限制性内切酶和DNA结合蛋白可用于位点特异性的标记或切割。这些方法，特别是化学修饰与酶法修饰的结合，为大规模制备功能化DNA材料开辟了道路。

可扩展的纯化与表征技术

大规模DNA处理的下一个关键步骤是高效纯化和准确表征。沉淀法（如乙醇/异丙醇沉淀）是浓缩和初步纯化DNA最常用的方法，但它对去除特定杂质（如内毒素、蛋白质）的效果有限。色谱技术，如离子交换色谱（IEX）、尺寸排阻色谱（SEC）和亲和色谱（例如基于固定化金属离子的磷酸骨架纯化），能够提供更高的纯度，但将其放大到工业生产规模需要优化成本和通量。

在表征方面，除了常规的紫外光谱（用于定量和纯度评估，如A₂₆₀/A₂₈₀比值）、凝胶电泳（用于分析大小和完整性）外，还需要更精细的技术来评估大规模产物的质量。高效液相色谱（HPLC）、质谱（MS）可用于分析修饰效率和化学计量。动态光散射（DLS）和多重光散射等技术有助于表征高浓度DNA溶液的流体力学性质和聚集状态，这对于材料应用至关重要。

结论与展望

将生物源DNA转化为先进的生物技术工具和材料，核心在于整合可扩展的获取、精确的修饰和高效的纯化策略。通过明智地选择DNA来源（权衡成本、序列控制与规模），开发适用于dsDNA的稳健修饰化学，并建立与之匹配的高通量纯化与表征工作流程，我们有望突破当前DNA技术主要局限于实验室小规模应用的瓶颈。未来，随着合成生物学和代谢工程的发展，或许能设计出“定制”的生物源DNA（如生产特定序列的工程化噬菌体），进一步模糊生物提取与化学合成之间的界限，最终推动DNA材料在传感、纳米技术、药物递送和数据存储等下一代应用中的广泛实现。