揭示关于老化牙齿上双物种致病性生物膜形成的新见解：天然牙本质模型与人工生物工程牙本质模型的比较分析

《Applied and Environmental Microbiology》：Unraveling novel insights into dual-species cariogenic biofilm formation on aged teeth: a comparative analysis on natural vs artificial bioengineered dentin models

生物膜形成；人工牙本质模型；多菌种共培养；微生物粘附；糖原合成酶；假丝酵母菌致病性。

　　口腔龋齿是全球最普遍的生物膜相关疾病之一，影响着数十亿人，其中包括老年人群体。传统的生物膜研究方法依赖于人类或动物来源的样本，这在获取性、成本以及伦理问题上都带来了挑战。尽管体外系统提供了一种有前景的替代方案，但它们往往无法准确复制牙本质的结构特征，而这些特征在细菌附着过程中起着关键作用。为了弥补这一差距，研究人员最近开发了一种生物工程牙本质结构，作为研究与牙本质相关的生物膜形成的可重复且易于获取的模型。因此，本研究旨在评估**Streptococcus mutans**（S. mutans）和**Candida albicans**（C. albicans）在生物工程牙本质基质上的双菌种生物膜形成情况，并将其与自然人类老化牙本质上的生物膜形成进行比较。通过使用高分辨率共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）对双菌种生物膜和胞外多糖基质的形成进行表征，研究人员还利用COMSTAT软件对生物膜的生长参数进行图像处理，同时通过微孔板读数量化荧光强度，并使用Live/Dead活性试剂盒评估细胞活力。研究结果显示，生物工程牙本质与老化牙本质上的生物膜形成模式相似，且在生物膜的物理特性和细胞活力方面没有显著差异。这些发现表明，生物工程牙本质结构为研究与牙本质相关的生物膜形成提供了一个可靠的平台，使其成为在可控条件下研究微生物附着和龋齿相关生物膜发展的有价值的工具，可能为未来研究与生物膜相关的口腔疾病提供支持。

在口腔健康领域，龋齿是一种严重影响全球人口的慢性疾病，其发展与复杂的微生物生物膜密切相关。然而，目前用于研究这些生物膜的实验室模型通常依赖于人类或动物组织，这不仅在标准化方面存在困难，还涉及伦理挑战。本研究验证了一种能够准确模拟老化人类牙本质微结构的生物工程牙本质模型，这一结构是老年人根部龋齿发生的关键场所。通过比较在人工和天然基质上由临床重要的S. mutans和C. albicans形成的生物膜，研究人员展示了该模型能够支持生物膜的发展，并能够检测微生物毒力的变化。总体而言，这一平台为研究口腔生物膜提供了一个可重复且可扩展的替代方案，有望用于理解疾病发生机制、新治疗方案的测试以及整合到下一代器官芯片系统中。

在研究龋齿的背景下，理解宿主与病原体在牙齿表面的相互作用对于揭示新的治疗策略至关重要。到目前为止，用于在可控实验室条件下研究口腔生物膜形成的实验方法主要包括体外研究、动物模型以及使用新鲜人类牙本质样本的体外实验。然而，这些方法可能成本高昂，且获取动物或人类样本可能带来显著的生物伦理和实验挑战。近年来，微制造和微流体设备的发展使得动态体外实验变得更加可行，且成本更低，已被成功应用于研究多种器官的病理生理学，如心脏、肝脏等。基于这一技术，研究人员开发了“牙齿芯片”模型，用于模拟不同的口腔环境，研究微生物、细胞和生物材料之间的相互作用。这些模型可以用于研究生物膜附着等关键方面；然而，现有的牙齿芯片模型仍然缺乏对生物膜在牙本质上形成的关键因素——基质微地形的考虑。此外，虽然许多静态体外模型通过模拟光滑牙釉质表面的羟基磷灰石（HAP）圆盘来研究生物膜附着，但牙本质组织的研究仍然较少。这在一定程度上是由于牙本质在天然牙齿中比牙釉质更为丰富，而随着年龄增长，牙釉质因生理过程如磨损、磨擦和侵蚀而逐渐变薄。据估计，65岁以上老年人的牙釉质厚度比新萌出牙齿减少了约三分之一，这使得牙本质成为研究生物膜形成，尤其是针对老年群体的冠部和根部龋齿的重要基质。

牙本质是一种具有管状微结构的组织，主要由无机羟基磷灰石（HAP）构成，但也含有约20%的I型胶原蛋白有机基质。牙本质暴露不仅由年龄相关的牙釉质流失引起，还可能由病理或机械因素如龋齿、创伤或牙龈退缩导致，据估计影响全球三分之二的人口，且在老年人中更为常见。最重要的是，牙本质暴露使得口腔生物膜更容易定植，从而增加深龋和根部龋的发生风险，可能导致牙齿活力丧失。尽管牙本质的组成及其与粘合剂、修复材料或再生材料的相互作用是牙科领域广泛研究的主题，但现有模型很少考虑牙本质结构对微生物附着和随后生物膜形成的影响。

S. mutans是研究最广泛的龋齿相关物种之一，它通过与唾液蛋白层——即由黏蛋白、凝聚素和脯氨酸丰富的蛋白（PRPs）组成的获得性牙本质蛋白层——的特定粘附素相互作用来启动定植。然而，S. mutans也可以通过如Cnm、Cbm、SpaP和WapA等粘附素直接与组织胶原蛋白结合。在存在蔗糖的情况下，S. mutans会通过葡萄糖基转移酶（如GtfB）产生胞外葡聚糖（EPS），促进生物膜基质的形成，从而增强生物膜的发展和稳定性。此外，S. mutans还与C. albicans表现出协同关系，两者共同参与婴儿和老年根部龋齿的快速进展。C. albicans是一种机会性真菌，是口腔中常见的定植者，占健康成年人的30%至35%，而在老年人中可高达75%。其在假牙佩戴者中的比例可达60%至75%，这通常与义齿性口炎相关。尽管C. albicans本身不被认为是强致龋菌，但在混合菌种生物膜中起着关键作用。其增强生物膜生物量、增加酸产生和促进组织侵袭的能力，尤其是在与S. mutans协同作用时，支持其作为龋齿过程中的关键微生物贡献者。

随着年龄增长，根部龋齿的发生风险增加，同时C. albicans的患病率也上升。值得注意的是，C. albicans在55岁以上人群的根部龋齿病变中已被分离出来，并且与S. mutans的丰度呈正相关。尽管没有研究直接将年龄、根部龋齿和Candida定植联系起来，但这些因素的交汇表明C. albicans可能在与年龄相关的生物膜失衡中起协同作用，推动根部龋齿的发生。此外，衰老过程中晚期糖基化终产物（AGEs）的积累已被与胶原蛋白结构的变化相关联，因为它们在纤维之间起到交联作用，并改变富含胶原蛋白组织的机械特性。在牙本质的具体背景下，这一现象导致胶原蛋白基质的刚度增加。此外，最近关于细菌在糖基化牙本质上的附着研究表明，糖基化可能增强生物膜的附着和生长，这或许部分解释了老年人和糖尿病患者中生物膜失衡的差异。

为了解决对牙本质上细菌附着的研究空白，并将这些研究整合到微流体设备中，我们的研究小组最近开发了一种模拟牙本质管状结构的生物工程牙本质构建体。这些构建体可以通过甲基甘醇（MGO）进行糖基化处理，以模拟牙齿老化过程，提供一致且可预测的基质，从而确保实验结果的可重复性。此外，其缩小的组成减少了试剂使用成本，并解决了获取和处理人类和动物材料可能带来的潜在伦理问题。

尽管在实验方法上取得了这些进展，这些生物工程构建体是否能够支持与天然老化牙齿类似的口腔生物膜的生长和发展仍不清楚。因此，本研究旨在比较在富蔗糖环境中，老化人工牙本质和老化天然人类牙本质上的早期龋齿相关生物膜形成情况，通过使用临床相关的S. mutans和C. albicans双菌种生物膜进行实验。为了实现这一目标，研究人员采用了标准化的实验设计，包括使用96孔板进行培养，并在24小时后评估生物膜的形成情况。

在评估生物膜形成时，研究人员首先检查了生物工程牙本质构建体是否能够支持细菌的活性，与天然牙本质进行比较。结果显示，无论是在生物工程牙本质还是天然牙本质上的生物膜，其细胞活性均约为80%，且在两种基质上没有显著差异。构建体由PDMS（聚二甲基硅氧烷）、HAP和MGO组成，后者用于模拟胶原蛋白的糖基化。尽管MGO已知对细胞具有一定的细胞毒性，但在细菌接种前将其用于表面糖基化处理并未影响生物膜的活性，这可能是由于在实验前将未反应的MGO清洗出系统。因此，MGO衍生的糖基化处理可以在不影响后续生物膜活性的情况下进行，表明该生物工程构建体具有良好的生物相容性，能够支持与天然牙本质类似的生物膜生长。

接下来，研究人员利用CLSM（共聚焦激光扫描显微镜）对24小时培养后的基质上的生物膜结构进行了分析。图像显示，S. mutans和C. albicans形成的双菌种生物膜呈现出紧密、多层的结构。S. mutans主要集中在基质表面附近，而C. albicans则在垂直轴上延伸，有时占据生物膜的上层。这些特征与文献中报道的在羟基磷灰石基质上的生物膜结构相似。此外，定量分析显示，生物膜的各个参数（如生物量、粗糙度、最大厚度、平均厚度、厚度与生物量比、表面积与生物体积比）在两种基质之间没有显著差异，进一步证实了生物膜结构的相似性。

为了进一步验证生物膜的组成，研究人员还使用了微孔板荧光计进行分析。结果显示，Calcofluor（用于标记C. albicans的荧光标记物）是最丰富的荧光标记物，其次是SYTO9（用于标记S. mutans）和Alexa Fluor 647（用于标记EPS）。这一结果表明，生物膜的主要成分由C. albicans构成，其次是S. mutans和EPS。此外，EPS信号较低，与CLSM图像中的观察结果一致。最重要的是，两种基质上的荧光标记物比例相似，表明该体外模型能够提供与体内环境相关的生物膜组成和结构的近似。

在评估生物膜毒力时，研究人员通过定量实时PCR（qPCR）检测了关键毒力基因的表达情况。结果显示，S. mutans的spaP和gbpB基因在存在蔗糖的环境中显著上调，而gtfB基因则未见明显变化。这一现象可能与基因表达的时间动态有关，gtfB可能在生物膜发展的指数期（4-6小时）表现出更高的转录活性，而在后期（如24小时）gbpB则成为主导基因。此外，微环境中蔗糖水平的降低可能导致gtfB表达的抑制，因为该基因对蔗糖浓度高度敏感。然而，C. albicans的ALS3和HWP1基因在存在蔗糖的情况下未见显著变化，这可能与这些基因对蔗糖的不直接响应有关。尽管如此，C. albicans的毒力基因表达可能受到S. mutans通过gtfB介导的葡聚糖合成的间接影响。然而，与预期相反，ALS3和HWP1的表达在24小时的封闭系统中被下调，这可能是因为在早期生长阶段这些基因的表达较高，而在后期可能受到生物膜成熟过程的影响。

尽管本研究存在一些局限性，如封闭微环境可能导致营养物质的早期耗尽，以及双菌种模型未能完全模拟口腔微生物群落的复杂性，但该生物工程牙本质构建体仍能够支持早期龋齿相关生物膜的发展和毒力研究。该构建体与标准96孔板格式兼容，并且可以适配微流体系统的集成，这使其在高通量应用和生物膜-微环境分析方面具有潜力。未来的研究将致力于将这一生物工程构建体整合到微流体系统中，以更精确地模拟体内条件，并测试抗微生物策略、营养调节或宿主-生物膜相互作用的效果。

总的来说，生物工程牙本质构建体在支持24小时双菌种S. mutans和C. albicans生物膜生长方面表现出色，其结构和组成与老化天然牙本质上的生物膜形成相似。这表明该体外模型可以作为研究老化牙齿上生物膜形成的可行替代方案，减少对人类或动物样本的需求。此外，该构建体还允许研究人员在不同的环境条件下，如蔗糖的存在与否或多种微生物相互作用，探索生物膜毒力的变化。然而，为了更全面地模拟实际的体内临床情况，未来的研究需要纳入更多的变量。无论如何，生物工程人工牙本质模型的开发为研究牙本质老化提供了诸多优势，包括提高实验的可重复性、降低成本以及减少对动物和人类样本的过度使用所带来的伦理问题。