基于骆驼科单域抗体的抗原检测方法的开发，用于泛特异性诊断人类和动物的布鲁氏锥虫（Trypanosoma brucei）活动性感染

《Journal of Clinical Microbiology》：Development of a camelid single-domain antibody-based antigen detection assay for the pan-specific diagnosis of active human and animal Trypanosoma brucei infections

非洲锥虫病（睡眠症）的诊断面临当前感染与既往感染难以区分的挑战。本研究开发了一种基于骆驼单域抗体（sdAbs）的抗原检测ELISA方法，靶向检测锥虫enolase（TbrENO）蛋白。通过优化sdAbs对TbrENO的特异性结合，建立sdAbsR3-77H/sdAbR2-103HA夹心ELISA，实验证明其可灵敏检测小鼠血浆中的TbrENO（最低检测限32 ng/mL），并与显微镜观察的寄生虫载量高度相关（R2=0.93）。临床样本验证显示，该ELISA能准确识别罗德西亚和冈比亚锥虫感染，尤其在晚期冈比亚睡眠症患者中仍保持高灵敏度（PPV=98%）。该技术克服了传统抗体检测的交叉反应问题，为现场快速诊断和治愈评估提供了新工具，兼具人类和动物感染检测的潜力。

　　非洲锥虫病是一种由寄生虫 *Trypanosoma brucei* 引起的严重疾病，对人类和动物健康造成重大威胁。在人类中，这种疾病被称为“昏睡病”（sleeping sickness），而在动物中则被称为“纳格纳”（nagana）。这种疾病主要影响撒哈拉以南非洲地区，同时也对亚洲和南美洲的经济发展构成挑战。由于感染后宿主体内会持续存在由寄生虫引发的抗体，传统的基于抗体的检测方法在区分当前感染和过去感染方面存在困难，从而限制了其在临床诊断中的应用。为了克服这一障碍，研究人员开发了一种新型的抗原检测方法，利用骆驼单域抗体（sdAbs，也称为纳米抗体）来识别 *Trypanosoma brucei* 的一种关键蛋白——烯醇化酶（*Tbr*ENO）。该方法在实验性感染的小鼠中表现出良好的性能，并且在监测慢性感染过程中显示出作为“治愈测试”工具的潜力。此外，该方法在人类临床样本中也表现出较高的诊断价值，能够检测早期和晚期的 *Trypanosoma brucei rhodesiense* 感染以及晚期的 *Trypanosoma brucei gambiense* 感染。因此，这种基于 *Tbr*ENO 的检测方法有望成为一种适用于人类和动物的广谱诊断工具，为锥虫病的防控提供新的思路。

### 检测方法的重要性

非洲锥虫病不仅对人类健康构成严重威胁，还会导致严重的经济负担，特别是在农业和畜牧业领域。该病的严重性在于其症状可能逐渐发展为神经系统损害，包括嗜睡、认知功能下降和昏迷，严重时可致命。相比之下，动物锥虫病（AAT）主要影响牲畜，症状包括发热、贫血和体重减轻，虽然对人类不直接构成生命威胁，但某些情况下可能通过人畜共患病传播给人类。因此，对非洲锥虫病的早期诊断和及时治疗至关重要，而目前的诊断方法在这一方面存在诸多限制。

传统的显微镜检测方法被认为是非洲锥虫病的“金标准”，但由于其敏感性较低，特别是在感染早期和慢性阶段，无法有效识别所有病例。而基于核酸的诊断方法虽然在敏感性和特异性方面有所提升，但因其需要复杂的设备和试剂，难以在资源有限的地区推广使用。基于抗体的检测方法，如酶联免疫吸附测定（ELISA）和侧流免疫层析试纸条，虽然在一定程度上有助于诊断，但它们的问题在于：在感染早期抗体水平可能低于检测限，导致假阴性结果；感染引起的交叉反应可能降低检测的特异性；此外，感染清除后抗体可能仍长期存在，从而产生假阳性结果。这些问题限制了基于抗体的检测方法在实际应用中的可靠性。

相比之下，基于抗原的检测方法能够直接检测寄生虫释放的蛋白，从而更准确地确认当前感染。这种方法的优势在于：（1）能够提供明确的感染证据，而非仅依赖宿主免疫反应；（2）由于靶向寄生虫特异性抗原，可以减少假阳性结果，提高诊断的准确性；（3）能够在短时间内提供快速且可靠的结果，有助于及时采取治疗措施，防止疾病进展；（4）抗原检测方法通常设计为快速诊断工具，操作简便，对技术人员的依赖程度较低，非常适合在偏远地区和移动医疗单位中使用。然而，传统的抗原检测方法通常依赖于常规抗体，而这些抗体在检测过程中可能与宿主抗体产生竞争，影响检测的准确性。

### 骆驼单域抗体的优势

骆驼单域抗体（sdAbs）作为一种新型的抗体技术，展现出克服上述问题的潜力。sdAbs是骆驼中发现的一种独特的重链抗体（heavy-chain-only antibody）的可变抗原结合域。与常规抗体相比，sdAbs具有更高的溶解性、更长的互补决定区（CDRs，尤其是CDR3）以及更大的抗原结合表面积，使其能够识别常规抗体难以接触的抗原位点。此外，sdAbs与宿主抗体的交叉反应较少，这有助于提高检测的特异性。同时，它们在热稳定性和易于通过细菌或酵母进行重组表达方面也具有显著优势，这些特性使其成为开发诊断和治疗工具的理想选择。

### 新型抗原检测方法的开发

本研究中，研究人员利用骆驼sdAbs开发了一种基于 *Tbr*ENO 的广谱抗原检测方法。*Tbr*ENO 是 *Trypanosoma brucei* 的一种关键蛋白，且在所有 *T. brucei* 的亚种中均保持100%的氨基酸序列一致性，因此成为一种理想的检测靶标。通过筛选多种sdAbs，研究人员最终确定了两个具有最佳性能的sdAb对：sdAb11H/sdAbR1-10HA 和 sdAbsR3-77H/sdAbR2-103HA。这两种组合在实验性感染的小鼠模型中表现出优异的检测能力，能够准确识别 *Tbr*ENO 的存在，并且在治疗后迅速失去信号，表明其可以作为“治愈测试”工具。

进一步的实验表明，sdAbsR3-77H/sdAbR2-103HA 组合在检测灵敏度方面优于 sdAb11H/sdAbR1-10HA。在实验性感染的小鼠中，该组合能够在感染后第6天检测到 *Tbr*ENO，即使在寄生虫数量降至显微镜检测限以下时，仍能维持较高的信号强度。这一发现表明，该方法能够检测寄生虫在血液中的微弱存在，从而提高诊断的准确性。此外，在治疗后48小时内，ELISA信号迅速下降，进一步支持其作为“治愈测试”工具的可行性。

在人类样本中，该方法也表现出良好的检测性能。研究人员使用来自世界卫生组织（WHO）的临床样本进行验证，其中包括20例确诊的 *T. b. rhodesiense* 和 *T. b. gambiense* 感染患者，以及10例未感染的对照样本。结果表明，所有 *T. b. rhodesiense* 感染样本均在ELISA中显示出高于对照组的信号，而 *T. b. gambiense* 感染样本中，有4例在晚期表现出阳性信号。值得注意的是，该方法在早期感染中未检测到任何假阳性结果，表明其具有良好的特异性。

### 方法的适用性与未来展望

除了对人类样本的检测，该方法还适用于动物样本，特别是针对 *T. brucei* 的不同亚种，包括 *T. b. brucei*、*T. b. gambiense*、*T. b. rhodesiense*、*T. b. evansi* 和 *T. b. equiperdum*。此外，研究人员还测试了该方法对其他可能共感染的寄生虫（如 *Leishmania infantum* 和 *Plasmodium chabaudi*）的特异性，结果表明其不会产生交叉反应。虽然 *Trypanosoma cruzi* 与 *T. brucei* 的烯醇化酶在序列上存在高度相似性，但实验表明该方法在使用 *T. cruzi* 裂解物时并未产生信号，说明其具有良好的特异性。

然而，该方法仍存在一些局限性。例如，在寄生虫数量较低的慢性感染中，可能会出现检测信号低于检测限的情况，导致假阴性结果。因此，进一步的研究可能需要开发双价或多价的sdAbs以提高检测灵敏度。此外，目前该方法尚未在广泛的临床和现场样本中进行全面验证，特别是脑脊液（CSF）样本，这在晚期昏睡病的诊断中至关重要。因此，未来的研究方向可能包括将该方法转化为更便捷的侧流检测格式，以便在资源有限的地区进行快速诊断。

### 结论

本研究开发了一种基于骆驼单域抗体的新型抗原检测方法，能够准确识别 *T. brucei* 感染，并且在治疗后迅速失去信号，显示出作为“治愈测试”工具的潜力。该方法在实验性感染的小鼠模型中表现出较高的灵敏度和特异性，并且在人类样本中也具有良好的诊断能力。由于其能够检测当前感染，而不是仅依赖宿主抗体，因此为非洲锥虫病的防控提供了新的工具。未来的研究可以进一步优化该方法，提高其在低寄生虫密度情况下的检测能力，并探索其在不同环境下的适用性，从而为全球范围内的疾病控制提供更有效的解决方案。