综述：利用无细胞DNA PCR非侵入性诊断侵袭性真菌病

《Journal of Clinical Microbiology》：Non-invasive diagnosis of invasive fungal disease with cell-free DNA PCR

本综述系统阐述了血浆/血清真菌无细胞DNA(cfDNA)PCR在侵袭性真菌病(IFD)诊断中的最新进展。文章重点分析了该技术针对侵袭性曲霉病(IA)、毛霉病和耶氏肺孢子菌肺炎(PJP)的诊断性能，并比较了其与传统非侵入性生物标志物(如GM和BDG)的优劣。作者还探讨了整合cfDNA PCR的诊断流程、其临床影响与预后价值，并强调了诊断管理的重要性。该技术为IFD的快速、准确诊断提供了新途径，尤其适用于无法进行侵入性采样的危重患者。

　　

侵袭性真菌病(IFD)是免疫功能低下人群发病和死亡的主要原因。早期诊断面临诸多挑战，包括非侵入性真菌生物标志物灵敏度低且缺乏特异性，通常需要通过支气管镜检查和活检进行侵入性标本采集，以及培养和组织病理学方法的局限性。通过聚合酶链式反应(PCR)检测血浆和血清中的循环真菌无细胞DNA(cfDNA)代表了一种新颖的检测方式，为IFD的快速、准确诊断带来了希望。

前言

IFD的发病率在过去十年中有所增加，这是由于接受免疫抑制治疗的患者群体不断扩大，包括器官移植、恶性肿瘤、自身免疫性疾病和2019冠状病毒病(COVID-19)患者。尽管IFD的早期诊断和治疗与较低死亡率相关，但其准确诊断受到几个挑战的阻碍。首先，由不同霉菌引起的IFD在影像学和临床表现上存在显著重叠，但治疗方法各异，这使得实验室诊断至关重要。其次，传统的真菌诊断方法，如真菌培养和组织病理学，分别存在灵敏度低和特异性不足的问题，并且通常需要通过支气管镜检查和活检收集侵入性标本。然而，由于临床状况不稳定、存在血小板减少症或凝血病，只有一部分疑似IFD患者能够接受侵入性操作。第三，当真菌培养呈阳性时，实验室通常需要数天至数周来分离和鉴定微生物。最后，可用的非侵入性真菌生物标志物，如血清曲霉半乳甘露聚糖(GM)和1-3-β-D-葡聚糖(BDG)，在诊断IFD方面缺乏敏感性和/或特异性，从而限制了它们在临床实践中精确识别真菌病原体的效用。由于这些诊断挑战，IFD的准确诊断常常被延迟，这导致优化抗真菌治疗的延迟启动，并常常使患者暴露于不必要的抗菌药物及其相关毒性之下。

检测血浆和血清中的循环无细胞DNA(cfDNA)片段，通常也被通俗地称为“液体活检”，是一种新型的非侵入性检测方式，可用于快速诊断各种疾病，并为目前需要侵入性操作来收集诊断标本的传染病诊断带来了巨大希望。真菌cfDNA PCR于十多年前由欧洲微生物学家实施，并已显示出在准确诊断IFD方面的良好结果。本综述总结了血浆和血清真菌cfDNA PCR在诊断侵袭性曲霉病(IA)、毛霉病和耶氏肺孢子菌肺炎(PJP)方面的性能特征。在可能的情况下，我们将比较血浆和血清cfDNA PCR与传统非侵入性血清真菌生物标志物（如GM和BDG）的准确性。我们还讨论了整合血浆真菌cfDNA PCR的诊断算法，以及当非侵入性cfDNA PCR先行时，侵入性标本采集的附加价值。最后，我们讨论了诊断管理在真菌cfDNA PCR检测中的作用。

分析前因素

两项研究分析前变量对真菌无细胞DNA检测影响的研究表明，血浆在检测曲霉cfDNA的灵敏度方面优于血清（分别为91%对80%和95%对68%），这可能是由于cfDNA在血凝块中的丢失所致。然而，这对于其他霉菌（如毛霉目病原体）是否属实，以及是否依赖于提取方法，仍有待证实。对于下游PCR检测，常用的K2乙二胺四乙酸(EDTA)采血管已被证明在回收微生物cfDNA方面比专用的cfDNA采血管灵敏度显著更高。一旦血液被采集，血浆收集的处理可以延迟至少24小时而不会影响PCR对cfDNA的检测。单次低速离心（500×g，10分钟）从细胞组分中分离血浆已被证明是足够的。基于加标实验，血浆可以在-80°C下长期储存而不会损失cfDNA的活性。用于提取核酸的血浆或血清体积已被证明是下游微生物cfDNA检测的关键因素。已发表的研究报告称，成人4 mL血浆为优化体积，儿科患者1 mL为最小体积。最后，商业核酸提取仪已被证明对较长和较丰富的cfDNA片段（如人类cfDNA）存在偏好，某些方法在提取较短且丰度较低的微生物cfDNA方面表现优于其他方法。需要进一步研究来确定真菌cfDNA的大小分布，并确定真菌cfDNA主要是裸露的还是在细胞外囊泡中膜结合的。这类知识可能允许开发人员优化真菌cfDNA的提取，并提高真菌cfDNA PCR的诊断灵敏度。此外，需要进行研究来解读患者免疫状态和真菌物种在血液中可检测cfDNA的生成和周转中的作用。先前关于毛霉病的研究表明，免疫抑制是毛霉目cfDNA PCR灵敏度较高的决定因素，但在球孢子菌病患者中未观察到这种关联。因此，使用PCR敏感检测真菌cfDNA以诊断IFD可能取决于患者的免疫状态和真菌物种。

分析因素

许多实验室自行开发的PCR方法已被报道，并且也有几种非美国食品药品监督管理局(FDA)批准的商业检测方法可用于引起IFD的真菌检测。敏感检测cfDNA的重要考虑因素包括选择靶向多拷贝序列（如核糖体RNA基因）的PCR检测方法，并选择短扩增子（<100 bp），因为已有研究表明血浆中的细菌和人类cfDNA由短片段组成。

侵袭性曲霉病

在已发表的针对IA患者的研究中，血浆或血清曲霉cfDNA PCR的总体汇总灵敏度和特异性分别为73.5%和87.6%。灵敏度和特异性范围很广，这可能归因于分析前变量的差异，包括检测指征和患者群体，以及分析因素。在高危无症状患者中筛查IA的研究与检测疑似IA的有症状患者相比，灵敏度显著更高；实验室开发检测与商业检测相比也是如此。然而，在灵敏度和特异性之间存在权衡，即在检测有症状患者和使用商业检测时观察到更高的特异性。在接受和未接受霉菌预防治疗的患者之间，以及在血清与血浆之间，汇总灵敏度未发现显著差异，尽管在未接受霉菌预防治疗的患者和血浆中特异性显著更高。

未来，使用优化的分析前和分析变量，包括以血浆作为样本类型和大体积样本进行提取，对于评估曲霉cfDNA PCR准确性的研究将是至关重要的。一项最近的研究评估了经过分析前优化的曲霉血浆cfDNA PCR检测方法的临床准确性，报告总体灵敏度为86.0%，特异性为93.1%，在新诊断的IA患者中灵敏度为93.0%。在血液系统恶性肿瘤(HM)和造血干细胞移植(HSCT)患者中报告了最高的准确性。在其他免疫抑制人群，包括实体器官移植(SOT)患者中报告了中等灵敏度，这表明曲霉血浆cfDNA在非中性粒细胞减少症患者中可能仍然有用。此外，与先前不鼓励在接受霉菌预防治疗的患者中使用曲霉cfDNA PCR的研究不同，这项最近的研究证明了在接受霉菌预防治疗的患者中具有高特异性。

随着曲霉cfDNA PCR的性能通过分析前和分析优化得到改善，了解传统非侵入性生物标志物在IA诊断中的作用将至关重要。只有一项研究直接比较了曲霉血浆cfDNA PCR与血清GM在诊断IA方面的准确性。曲霉血浆cfDNA PCR在确诊或临床诊断IA患者中显示出显著更高的灵敏度，但在无IA患者中与血清GM相比具有相似的特异性。将血浆cfDNA PCR与血清GM结合使用，将所有患者的cfDNA PCR灵敏度从86.0%提高到93.5%，在新诊断的确诊和临床诊断IA患者中提高到100%。需要进一步研究来确定准确的曲霉cfDNA PCR检测方法的可用性是否限制了GM的效用和可操作性。

毛霉病

非侵入性cfDNA PCR对于毛霉病的诊断尤其具有吸引力，因为毛霉目病原体缺乏血清生物标志物，如GM和BDG。许多cfDNA PCR检测方法已被报道用于诊断侵袭性毛霉病。这些检测方法靶向毛霉目最常见的属，包括毛霉属、根霉属、根毛霉属，并且在某些检测中也包括横梗霉属，这取决于该病原体的当地流行病学情况。总体而言，血浆或血清毛霉目cfDNA PCR的汇总灵敏度和特异性分别为83.0%和95.7%。观察到灵敏度和特异性范围很广，这可能归因于分析前和分析变量的差异。在筛查毛霉病与研究检测有症状患者之间，汇总灵敏度和特异性未发现显著差异。虽然在血清与血浆之间以及实验室开发检测与商业检测之间汇总灵敏度未发现显著差异，但血清和商业检测的特异性显著更高。

研究还显示，毛霉目cfDNA PCR在免疫抑制患者与非免疫抑制患者中的灵敏度存在差异。一项经过分析前优化的毛霉目血浆cfDNA PCR检测方法报告，在免疫抑制患者中的灵敏度和特异性分别为92.1%和93.9%，而在非免疫抑制患者中分别为55.6%和86.4%。一项使用毛霉目血清cfDNA PCR的研究也报告了免疫受损患者与非免疫抑制患者相比更高的灵敏度。此外，在前一项研究中，毛霉目血浆cfDNA PCR在接受霉菌活性预防治疗的患者中保持了其灵敏度，支持其用于突破性感染患者。

耶氏肺孢子菌

当临床不稳定的患者无法获取支气管肺泡灌洗液(BAL)或诱导痰时，耶氏肺孢子菌血浆cfDNA PCR也可能有助于非侵入性诊断耶氏肺孢子菌肺炎(PJP)。早期研究耶氏肺孢子菌cfDNA PCR准确性的报告了相互矛盾的灵敏度。在最近的一项研究中，使用经过分析前优化的检测方法，耶氏肺孢子菌血浆cfDNA PCR在确诊PJP病例中显示出100%的灵敏度和93.4%的特异性。该检测在确诊或临床诊断病例中的准确性较低，灵敏度和特异性分别为48.6%和99.1%。将耶氏肺孢子菌血浆cfDNA PCR与BDG进行比较，两种检测在确诊PJP患者和确诊或临床诊断PJP患者中具有相似的灵敏度。然而，在可能性和无PJP患者中，耶氏肺孢子菌血浆cfDNA PCR的特异性显著高于BDG。因此，如果这些结果在其他研究中得到重现，耶氏肺孢子菌血浆cfDNA PCR可以取代BDG，成为疑似PJP患者中更特异但灵敏度相当的非侵入性诊断方法。

诊断流程

鉴于曲霉和毛霉目cfDNA PCR的高灵敏度，该检测方式的自然发展是确定非侵入性血浆cfDNA PCR是否可以取代通过支气管镜检查和活检收集的标本的侵入性真菌检测。一项最近的研究评估了霉菌血浆cfDNA PCR作为独立检测的潜力，该检测靶向曲霉属物种、毛霉目病原体、镰刀菌属、赛多孢霉属和多育勒特支孢霉，通过研究非侵入性霉菌血浆cfDNA PCR与使用传统真菌诊断方法检测的组织和BAL的侵入性检测结果的一致性。在对不一致病例根据欧洲癌症研究与治疗组织(EORTC)和真菌病研究组教育与研究联盟(MSGERC)病例定义进行裁定后，霉菌血浆cfDNA PCR与侵入性标本检测结果的一致性为88.5%。不一致性分析显示，64.7%的cfDNA PCR阴性的确诊IFD病例包括糖尿病患者的侵袭性真菌鼻窦炎和浅表肢体感染。作者指出，在此类病例中，及时的外科干预应作为治疗和诊断的标准护理，诊断不应依赖于cfDNA PCR的非侵入性检测。此外，作者认为部分不一致结果可能源于假阳性培养结果。在霉菌cfDNA PCR阴性的临床诊断IFD病例中，29.2%的病例仅在BAL培养中生长出1或2个真菌菌落，这可能代表定植、污染或短暂的孢子吸入，而非真正感染。最后，cfDNA PCR阳性但BAL培养阴性的不一致病例，占不一致病例的37.5%，可能是由于真菌培养的有限灵敏度与假阳性结果所致。鉴于这项研究以及其他关于曲霉和毛霉目cfDNA PCR高准确性的研究结果，一个实用的侵袭性霉菌病(IMD)诊断流程可以从对具有中高可能性患有播散性和肺IMD的患者开始进行非侵入性霉菌血浆cfDNA PCR检测开始，随后对cfDNA PCR结果阴性但仍具有高感染可能性且能够接受侵入性操作的患者进行非侵入性血清GM检测和侵入性检测样本（如BAL和组织）检查。这种方法解决了cfDNA PCR无法检测检测面板外霉菌的局限性。采用非侵入性霉菌cfDNA PCR可以通过减少对常规侵入性标本采集诊断IFD的依赖来提高医疗效率和质量，特别是在有不适合侵入性采样的禁忌症的不稳定免疫受损患者中。

临床影响与预后价值

真菌cfDNA PCR能够比传统诊断检测提前数天提供结果，从而允许更早开始优化抗真菌治疗并改善结局。在一项前瞻性研究中，毛霉目血清cfDNA PCR在组织病理学或微生物学诊断前中位4天呈阳性。类似地，曲霉血浆cfDNA PCR在通过常规方法做出确诊或临床诊断IA诊断前16.8天呈阳性。在一项针对疑似IFD患者的前瞻性研究中，真菌cfDNA PCR在36.2%的阳性结果患者中对临床管理产生了积极影响。在一项前后对照研究中，对血液科患者进行每周两次的毛霉目血清cfDNA PCR筛查与一个月全因死亡率降低48%相关。

除了cfDNA PCR在诊断IMD方面的效用外，研究表明毛霉目和曲霉cfDNA PCR还具有预后价值。已证明毛霉目和曲霉cfDNA PCR基线循环阈值与生存结局相关。类似地，基于血清cfDNA PCR的基线真菌负荷已显示与患者生存相关。此外，对于毛霉病，尽管开始抗真菌治疗，但重复cfDNA检测呈阳性与那些恢复cfDNA阴性结果的患者相比，生存率更差。因此，霉菌cfDNA PCR提供的预后信息可能有助于识别有不良结局风险的患者，这些患者可能受益于替代疗法。

诊断管理

尽管真菌cfDNA PCR可以在疾病进程早期建立IFD诊断方面发挥关键作用，从而改善临床管理和患者结局，但仍然需要诊断管理来提高检测的预测价值并减少资源过度使用。据报道，在初次阴性结果后的第一周内，重复霉菌血浆cfDNA PCR检测很少产生被认为具有临床意义的阳性结果。类似地，在基线阴性结果后的4周间隔内，重复双相真菌血浆cfDNA PCR的阳性率很低。因此，如果在其他研究中得到重现，限制在阴性结果后重复进行真菌cfDNA PCR检测以改善资源利用和防止假阳性结果是合理的。

总结

真菌cfDNA PCR已被证明在诊断确诊和临床诊断IFD患者的IA和毛霉病方面具有高灵敏度和特异性。需要进一步研究来测量cfDNA PCR诊断由其他病原体引起的IFD的准确性，例如念珠菌属、镰刀菌属、赛多孢霉属、多育勒特支孢霉、耶氏肺孢子菌和双相真菌。需要进行前瞻性研究，使用临床样本调查分析前和分析变量，并确定哪些变量对真菌cfDNA PCR准确性影响最大。需要进一步研究来确定连续检测在治疗监测方面的作用。当前真菌cfDNA PCR面临的挑战包括其有限的可及性，因为它们目前在某些国家仅作为实验室开发检测(LDT)提供。然而，鉴于最近法院反对FDA对LDT进行监管的裁决，预计美国将有更多实验室开始以LDT形式提供真菌cfDNA PCR检测。无论如何，未来的需求包括在完全自动化仪器上商业化基于卡盒的检测方法，以实现快速的近患者检测。此类进展可能会增加真菌cfDNA PCR的使用并改善患者结局。