综述：动物钩端螺旋体病的诊断：挑战与展望

这篇综述系统阐述了动物钩端螺旋体病（Leptospirosis）的诊断挑战，指出其流行病学、临床表现及诊断方法因宿主物种和流行血清型差异而显著不同。文章重点分析了显微镜检查、培养、分子诊断（如PCR、LAMP、RPA）、血清学检测（如MAT、ELISA）等多种技术的优劣，并强调了开发高灵敏度、高特异性且适用于基层（POC）的快速诊断工具的迫切性。

　　

钩端螺旋体病是一种危及生命的人畜共患疾病，对公共健康和动物健康具有重大影响。每年约有103万人感染钩端螺旋体病，但人们对其在动物中的影响了解有限。该病在人类和动物中的流行病学、发病机制、临床表现、诊断方法和控制措施存在显著差异。这种差异部分是由于可感染的动物物种范围广泛，跨物种和地理区域存在的感染血清型不同，以及慢性无症状携带者的存在。

临床表现在不同动物物种中的差异

动物物种通常表现出一系列广泛的临床症状。大多数急性临床病例在最初的菌血症阶段表现为发热性疾病，但由于症状非特异性，在许多动物中往往被忽视。出现临床病理学异常的动物，包括肝肾功能障碍的标志物，应被视为疑似病例。然而，并非所有物种都会出现明显的肝或肾功能障碍。在反刍动物中，繁殖障碍是慢性定植的主要表现之一。在马中，除了全身性疾病外，眼睛的慢性定植可导致复发性马葡萄膜炎和失明。

钩端螺旋体检测方法

多种方法用于检测动物体内的钩端螺旋体。

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  显微镜检查
  钩端螺旋体是细小的螺旋体细菌，无法通过明场显微镜或常规革兰氏染色观察。然而，某些染色法可推定检测钩端螺旋体。暗视野显微镜（DFM）可用于检测临床标本（如体液）中数量丰富的钩端螺旋体。该检测方法灵敏度低、特异性差，且许多实验室没有配备暗视野显微镜。银染（如Warthin-Starry）可用于辅助观察福尔马林固定的组织样本中的病原体，但并非钩端螺旋体特异性。使用FITC标记的多克隆抗钩端螺旋体抗体的免疫荧光 assay（IFA）可以鉴定临床样本（如尿液和组织）中钩端螺旋体的存在，但荧光显微镜的要求限制了其应用。
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  钩端螺旋体培养
  虽然从感染宿主中分离和鉴定病原体通常被视为金标准，但对于钩端螺旋体这类难以培养的细菌，这种方法可能意义有限，因为其生长要求独特且孵育时间长。Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris（EMJH）培养基是最常用的实验室培养基之一。近年来开发的HAN培养基在分离挑剔的钩端螺旋体菌株方面表现出优势。钩端螺旋体的代时为6至20小时，某些病原菌种（如L. borgpetersenii）需要更长的孵育时间。污染是培养过程中的一个主要问题，通常需要添加抗菌剂（如5-氟尿嘧啶或STAFF抗生素鸡尾酒）来防止污染。样本处理和运输对分离成功率有显著影响。培养通常不用于临床钩端螺旋体病的诊断，但对于流行病学研究、疫苗和诊断方法开发至关重要。
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  分子诊断
  核酸扩增试验（NAAT）已广泛用于动物物种感染的检测。其较高的灵敏度和特异性允许更早地进行特异性检测和干预。多种PCR assay靶向多个基因靶点，如lipL32、secY、lfb1、rrs和flaB，其中lipL32是最常用的靶点。数字PCR（dPCR）具有抗抑制剂能力强、可精确定量等优点，但成本和标准化是限制因素。环介导等温扩增（LAMP）和重组酶聚合酶扩增（RPA）等快速扩增方法已被探索用于钩端螺旋体检测，更适合资源有限地区。CRISPR/Cas-based检测平台（如DETECTR, HOLMES, SHERLOCK）提供了更高的特异性。适配体（aptamer）诊断方法是另一种有前景的工具。
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  钩端螺旋体分离株的表征
  鉴定钩端螺旋体分离株的物种和血清型对于研究流行病学和指导疫苗抗原选择至关重要。传统的血清分型方法（交叉凝集吸附试验）繁琐且仅在参考实验室可用。基于DNA的方法，如多位点序列分型（MLST），已被开发用于基因分型。全基因组测序（WGS）已成为表征钩端螺旋体分离株的常用工具，是物种和菌株水平分类的金标准。分析编码脂多糖（LPS）生物合成的rfb基因座有助于血清型区分。基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）也是一种有前景的快速鉴定技术。
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  宏基因组测序
  宏基因组测序可以全面识别临床样本中的病原体核酸。有报道显示，在常规诊断测试（如MAT和PCR）失败时，该方法成功检测出钩端螺旋体。使用捕获探针（capture probes）后进行测序作为一种无需培养的分离方法日益流行，但成本和技术要求高。富集培养后结合宏基因组测序可用于识别和表征钩端螺旋体菌株，且不牺牲灵敏度。

宿主反应的检测

检测宿主对钩端螺旋体暴露产生的免疫反应是诊断的另一重要方面。

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  显微镜凝集试验（MAT）
  MAT是检测抗钩端螺旋体抗体最古老且常用的血清学方法之一。虽然被视为参考血清学测试的金标准，但其在临床诊断中的效用有限。许多动物物种可能无症状携带细菌而不诱导凝集抗体反应。急性患病动物也可能MAT阴性。MAT结果受限于检测面板中包含的血清型，需要根据流行血清型进行定制。疫苗接种会使MAT滴度升高。高滴度不能完全可信地指示感染血清型。解释MAT结果因血清型间的交叉反应而复杂。技术因素（如生物安全、实验室间标准化差异）也需考虑。
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  其他血清学检测
  一些快速诊断测试（如侧向流动层析试纸条）可用于抗钩端螺旋体抗体的早期推定诊断。针对病原性钩端螺旋体丰富膜蛋白（如LipL32）的检测以及针对钩端螺旋体全细胞提取物的IgM检测已用于犬类。商业化的动物钩端螺旋体病ELISA并不常见。开发酶联免疫吸附 assay（ELISA）的挑战在于需要适当验证并确保所用抗原能正确检测阳性和阴性样本。

尸检和组织病理学

死后检查结合组织病理学是排除钩端螺旋体病作为死亡原因的理想工具。病例可表现为无黄疸或黄疸形式。组织病理学变化在肝脏主要表现为肝细胞 dissociation，在肾脏可见肾小管坏死和间质性肾炎等。可疑病例可通过PCR或免疫组织化学（IHC）确认。IHC可在福尔马林固定的组织标本上可视化钩端螺旋体抗原。

总结

钩端螺旋体感染的流行病学、发病机制、临床表现、诊断方法和控制措施因易感动物物种范围广、流行血清型多样以及地理区域差异而差异显著。尽管有多种诊断方法可用于识别钩端螺旋体感染的动物，但每种方法在灵敏度、特异性、成本、可用性以及对专业技术需求方面都存在局限性。该领域的一个主要挑战是缺乏灵敏、特异且价格合理的现场护理（POC）诊断工具，特别是在资源有限地区。由于没有单一的检测方法完全可靠，通常需要采用多种诊断模式。受影响的动物物种多样性、流行钩端螺旋体菌株的地理变异以及慢性无症状携带者的存在，阻碍了标准化诊断指南的制定和实施。分子诊断（如PCR）根据基因靶点和样本类型提供了更高的灵敏度和特异性。鉴于动物钩端螺旋体病的临床症状在急性期通常非特异性且可能模仿其他疾病，建议采用综合征检测方法以利于早期干预。迫切需要更易获得和成本效益更高的工具来支持钩端螺旋体病流行地区的疾病检测。