通过将TGEV S-三聚体与PEDV D0-NTD拼接，成功构建了一种嵌合体。该嵌合体能够产生针对这两种病毒的强效中和抗体

《Journal of Virology》：Engineering a TGEV S-trimer chimera with PEDV D0-NTD generates potent neutralizing antibodies against both viruses

抗猪流行性腹泻病毒（PEDV）和传阅性胃肠炎病毒（TGEV）的嵌合S蛋白疫苗设计及免疫效果评价。通过替换TGEV S蛋白的D0和NTD结构域为PEDV对应区域，构建了七种嵌合S蛋白，并筛选出TGEV S-PEDV(D0/NTD)作为最佳候选。该蛋白在小鼠和猪模型中均诱导出广谱中和抗体，对TGEV的中和抗体滴度达2^13.6，对PEDV达2^5.8，且稳定性良好。研究证实基于TGEV三聚体框架整合PEDV关键免疫原域的策略可有效开发双价亚单位疫苗。

　　在当前全球畜牧业中，猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）作为两种主要的猪肠道冠状病毒，对猪群健康和经济收益构成了严重威胁。这两种病毒引起的疾病具有高度传染性，尤其是对2周龄以内的幼猪，感染后往往导致高死亡率，给养猪业带来巨大损失。因此，开发一种安全、有效且经济的疫苗，以同时防控这两种病毒，成为研究的重点。目前，尽管已有多种疫苗被广泛应用于预防这些病毒，但面对病毒的快速变异和免疫逃逸现象，传统疫苗在实际应用中仍面临挑战。本文研究了基于TGEV S蛋白设计的双价嵌合蛋白疫苗，旨在提高对PEDV和TGEV的交叉保护能力，为新型疫苗的研发提供了重要依据。

### 病毒的致病性和疫苗需求

PEDV和TGEV属于α冠状病毒属，它们的基因组长度约为28 kb，并具有5'端帽化和3'端多聚腺苷酸化的非翻译区（UTRs）。这些病毒的基因组通常包含七个主要的开放阅读框（ORFs），其中包括复制酶基因ORF1a和ORF1b，以及结构蛋白基因S、E、M和N，还有ORF3编码的辅助蛋白。其中，S蛋白作为病毒表面的主要包膜糖蛋白，在病毒感染过程中起着至关重要的作用。S蛋白可以分为S1和S2两个亚单位，S1负责与宿主细胞受体结合，而S2则参与病毒与靶细胞膜的融合。研究表明，S1-D0和S1-NTD区域是中和抗体的主要靶点，因此这些区域可能在疫苗设计中具有重要价值。

### 疫苗设计策略

为了提高疫苗的有效性，研究团队采用了一种新的设计策略，即通过将PEDV的S蛋白不同区域替换到TGEV的S蛋白三聚体骨架上，构建了七种不同的嵌合蛋白。这种设计方法不仅保留了TGEV S蛋白的结构优势，还结合了PEDV的免疫相关区域，以期实现更广泛的中和抗体诱导效果。研究中，通过使用哺乳动物表达载体系统在HEK293F细胞中表达了这些嵌合蛋白，并利用SDS-PAGE和Western blot技术验证了其表达和纯化效果。结果显示，TGEV S蛋白在三聚体结构上具有更高的均一性，这可能与其较强的免疫原性有关。

### 嵌合蛋白的表达和纯化

研究团队通过优化基因序列并引入特定的突变（如双脯氨酸突变）来提高嵌合蛋白的表达水平和稳定性。这些突变有助于增强蛋白质的结构稳定性，使其在表达和纯化过程中保持良好的功能状态。此外，为了确保蛋白的正确折叠和功能，研究中还使用了多种纯化方法，包括镍柱亲和层析和尺寸排阻色谱（SEC）。通过这些步骤，研究团队成功获得了具有高均一性和稳定性的嵌合蛋白。

### 免疫原性和保护效果评估

在小鼠模型中，研究团队评估了不同嵌合蛋白的免疫原性和保护效果。结果显示，TGEV S蛋白能够诱导比PEDV S蛋白更强的中和抗体反应，且其在小鼠体内表现出良好的免疫原性。相比之下，虽然PEDV S蛋白也能引发一定的免疫反应，但其中和抗体滴度较低。进一步的实验表明，TGEV S-PEDV(D0/NTD)嵌合蛋白在小鼠体内能够有效诱导针对TGEV和PEDV的中和抗体，其滴度甚至超过了TGEV S蛋白。这表明，将PEDV的D0和NTD区域整合到TGEV S蛋白中，可以增强其对两种病毒的交叉保护能力。

### 猪的免疫效果验证

为了验证嵌合蛋白在实际应用中的效果，研究团队进一步在猪身上进行了实验。他们选择了25只2个月大的、对PEDV和TGEV无免疫力的猪，将其随机分为五个实验组和一个对照组。各组猪分别接种了TGEV S、PEDV S、TGEV S-PEDV(D0/NTD)、TGEV S-PEDV(D0/NTD/CTD)和PBS。结果显示，TGEV S-PEDV(D0/NTD)组的猪在接种后产生了显著的中和抗体滴度，不仅对TGEV具有良好的保护效果，还能有效诱导针对PEDV的中和抗体。相比之下，TGEV S-PEDV(D0/NTD/CTD)组的猪对TGEV的中和抗体滴度较低，但对PEDV的中和能力与TGEV S-PEDV(D0/NTD)组相当。这说明，TGEV S-PEDV(D0/NTD)是具有广泛应用前景的疫苗候选者。

### 疫苗设计的科学依据

研究团队通过对TGEV和PEDV S蛋白的B细胞表位进行预测，进一步明确了其在疫苗设计中的关键区域。利用生物信息学工具，如SWISS-MODEL和DiscoTope 3.0，他们预测了两种病毒S蛋白的线性表位和构象表位。结果显示，这些表位主要分布在S1-D0、S1-NTD和S1-CTD区域，尤其是TGEV的S1-D0区域表现出更高的免疫原性。因此，将这些区域作为疫苗设计的核心，有助于提高疫苗的中和能力。此外，研究还发现，TGEV S蛋白的三聚体结构有助于增强其免疫原性，而PEDV S蛋白则在表达和纯化过程中表现出一定的挑战。

### 疫苗的优势与前景

与传统的全病毒疫苗相比，基于S蛋白的亚单位疫苗具有更高的安全性，因为它们不含感染性病毒基因组。此外，亚单位疫苗可以通过对抗原结构的重新设计，实现多抗原的组合，从而增强疫苗的保护效果。本研究中设计的TGEV S-PEDV(D0/NTD)嵌合蛋白，不仅在小鼠模型中表现出良好的免疫原性，还在猪的实验中验证了其对两种病毒的交叉保护能力。这表明，该疫苗具有广泛的应用前景，并可能成为未来防控PEDV和TGEV的重要工具。

### 研究的局限与未来方向

尽管本研究取得了显著成果，但仍存在一些局限性。例如，虽然TGEV S-PEDV(D0/NTD)在实验中表现出良好的免疫原性和保护效果，但其在不同环境下的稳定性和长期免疫效果仍需进一步研究。此外，疫苗的免疫持续时间和实际应用中的效果，还需要通过更多的临床试验和长期监测来验证。未来的研究可以进一步探索如何优化疫苗的表达系统，提高其在不同宿主中的适应性，并评估其在实际养殖环境中的应用效果。

### 结论

综上所述，本研究通过设计和构建TGEV S-PEDV(D0/NTD)嵌合蛋白，为开发一种有效的双价疫苗提供了新的思路。该疫苗不仅能够诱导针对TGEV和PEDV的中和抗体，还表现出良好的表达和纯化效果。这些发现为未来猪肠道冠状病毒的防控提供了重要的科学依据，并可能推动新型疫苗的研发进程。