纳米技术驱动的协同效应：姜黄素纳米悬浮液与氟康唑联合使用在克服白色念珠菌唑类抗性方面的研究效果

《Microbiology Spectrum》：Nanotechnology-driven synergy: research effects of curcumin nanosuspension and fluconazole combination in overcoming azole resistance in Candida albicans

抗真菌纳米制剂曲霉纳米悬浮液（CNS）与氟康唑（FLC）协同显著抑制白色念珠菌（C. albicans） planktonic cells 和 biofilm 形成，降低MIC值，并通过抑制药物外排泵（如Rhodamine 6G递送增强）和下调细胞粘附相关基因（ALS1, ALS3, HWP1, EFG1）发挥作用。

　　近年来，真菌感染的发病率持续上升，尤其是由白念珠菌（*Candida albicans*）引起的播散性念珠菌病，凸显了开发创新治疗策略的迫切需求。本研究评估了一种姜黄素纳米悬浮液（CNS）在单独使用和与azole类药物联合使用时的抗真菌活性，重点探讨其对抗药物耐受性的作用。CNS显著提高了姜黄素在体外的水溶性和缓释能力，克服了其固有的药代动力学限制。通过棋盘法实验，我们发现CNS与氟康唑（FLC）在游离细胞和早期生物膜中表现出协同效应，其协同指数（FICI）范围为0.38–0.5，而针对早期生物膜的协同指数低于0.5，进一步证明了CNS与FLC的协同作用。形态学分析表明，这种组合能够抑制白念珠菌的菌丝生长，并破坏生物膜结构，这是该菌的重要致病特性。进一步的机制研究表明，CNS可能通过促进药物摄取、抑制药物外排功能以及降低与附着相关的基因表达（如ALS1、ALS3、HWP1和EFG1）来增强抗真菌活性。这些结果突显了基于纳米技术的治疗策略在提升传统azole类药物疗效、应对耐药性真菌感染方面的巨大潜力。

白念珠菌是一种常见的共生真菌，广泛存在于人体微生物群中。然而，在免疫功能低下的人群中，如器官移植患者、艾滋病患者以及接受化疗的患者中，它成为重要的机会性病原体。这种真菌能够引发从表浅感染到严重系统性感染的多种疾病，甚至导致高达40%的死亡率。口腔是白念珠菌定植的常见部位，流行病学研究显示，新生儿中有45%、健康儿童中有45%–65%、健康成人中有30%–45%以及老年人中有高达74%的人群存在该菌。在免疫功能受损的宿主中，定植可能进一步发展为口腔念珠菌病。近期研究还表明，慢性白念珠菌感染可能具有致癌潜力。例如，Mothibe报告称，佩戴假牙的癌症患者中，真菌负荷显著高于健康对照组，而Berkovits则发现，口腔鳞状细胞癌患者中白念珠菌水平升高。这些发现提示，持续的真菌定植可能与口腔癌变存在潜在联系，需要进一步研究。此外，局部口腔感染可能发展为全身性感染，这使得预防和治疗口腔念珠菌病成为全球公共卫生的重要议题。

当前，白念珠菌感染的治疗主要依赖于有效的抗真菌药物，包括azole类药物（如氟康唑）、多烯类药物（如两性霉素B）、嘧啶类似物（如氟胞嘧啶）以及棘白菌素类药物（如卡泊芬净）。其中，氟康唑因其良好的生物利用度和成本效益，成为最常用于临床的药物之一。然而，长期和广泛使用氟康唑导致了耐药菌株的出现，这使得治疗效果变得复杂。此外，抗真菌药物种类有限，而白念珠菌感染的医疗负担日益加重，进一步凸显了开发新治疗方案的必要性。在此背景下，源自传统中药的天然产物引起了广泛关注，因其具有改善生物利用度和降低毒性的潜力。已有研究表明，如黄连中的小檗碱和黄芩中的黄芩素等中药成分，能够通过多靶点机制增强传统azole类药物的抗真菌效果。这些发现强调了植物来源药物在克服抗菌药物耐受性方面的前景。

姜黄素（CUR）是一种源自姜黄的天然化合物，以其广泛的生物活性和良好的安全性而闻名，包括抗菌、抗病毒、抗真菌和抗炎等作用。近年来的研究进一步揭示了其对多重耐药真菌和细菌病原体的有效性。此外，有证据表明姜黄素能够抑制白念珠菌的外排泵活性，这可能是其增强抗真菌效果的重要机制之一。将天然化合物如姜黄素与传统抗真菌药物结合，成为对抗药物耐受性的有希望策略。尽管具有这些潜力，姜黄素的临床应用仍受到其水溶性差、生物利用度低、代谢快以及难以穿透血脑屏障等限制。因此，改善这些特性，特别是水溶性和溶解速率，成为关键的研究方向。纳米技术作为一种有前景的方法，已被用于设计新型抗菌、抗真菌和驱虫剂。通过将药物制成纳米颗粒，纳米系统能够提高其稳定性、生物相容性和生物活性。本研究中，我们开发了一种姜黄素纳米悬浮液（CNS），其粒径分布均匀，具有良好的分散性和稳定性。与原始姜黄素颗粒相比，CNS的粒径显著减小，表面形态更光滑，从而提高了其溶解速率和生物利用度。研究表明，CNS的水溶性提高了超过40倍，并且在体外可在60分钟内完全溶解。

本研究旨在对抗耐药性和顽固的白念珠菌感染。我们采用标准化的白念珠菌生物膜模型，开发了CNS，并评估了其与氟康唑的联合抗真菌效果。此外，我们使用定量实时PCR（qRT-PCR）技术分析了与生物膜形成相关的基因表达，以阐明联合治疗抑制生物膜形成的分子机制。综上所述，本研究为克服生物膜相关抗性提供了一种有希望的纳米技术策略。

在实验中，我们通过倒置相差显微镜观察了白念珠菌生物膜的形成过程。初始的酵母形态在2小时后逐渐发展为芽管和假菌丝，随后在24小时时形成密集的菌丝网络。在48小时时，观察到成熟的生物膜结构，包括密集的酵母细胞、菌丝和细胞外基质（图1A）。通过XTT还原实验评估生物膜的代谢活性，发现其随时间推移逐渐增加，并在48小时时达到峰值（图1B），这表明48小时是后续药物测试的最佳时间点。扫描电子显微镜（SEM）进一步揭示了生物膜的高度互联结构，以及明显区分的真菌菌丝和假菌丝（图1C和D）。此外，芽殖位点和芽痕位置的变化也清晰可见（图1E和F）。基于这些形态学和代谢指标，我们选择了48小时作为所有后续抗真菌药物暴露实验的最优生物膜成熟阶段。

CNS的物理化学特性得到了充分验证。其平均粒径为147.0 ± 1.304纳米，多分散指数（PDI）为0.079 ± 0.013，电位为–28.8 ± 0.251毫伏。电子显微镜图像显示，原始的姜黄素颗粒形状不规则，呈杆状和微小颗粒，而CNS颗粒则呈球形，均匀分布且无聚集现象，表面形态光滑（图2C和D）。这些特性表明，CNS具有良好的稳定性和分散性。稳定性评估显示，CNS在前12小时内保持稳定，随后粒径逐渐增加，至24小时时达到约200纳米（图2E）。这些结果表明，CNS具备适合后续药学应用的稳定性。

通过MIC（最小抑菌浓度）和SMIC??（生物膜最小抑菌浓度）实验，我们评估了CNS与氟康唑对游离细胞和生物膜的抗真菌效果。结果显示，CNS单独使用时对游离细胞的MIC值大于256微克/毫升，表明其单独作用的抗真菌效果有限。然而，当CNS与氟康唑联合使用时，MIC值显著降低，协同指数（FICI）范围为0.25至0.5，表明存在显著的协同效应。在生物膜实验中，CNS显著降低了氟康唑的SMIC??值，从1024微克/毫升降至32–128微克/毫升，协同指数在0.25至0.38之间，显示了CNS在所有测试菌株中的一致协同效果。

为了进一步研究CNS与氟康唑的协同作用机制，我们通过Rh6G摄取和外排实验评估了它们对药物外排泵的影响。Rh6G和氟康唑都是白念珠菌细胞膜外排泵的底物，因此Rh6G被用作氟康唑的荧光替代物来监测运输活性。在初步实验中，我们选择了128微克/毫升的CNS浓度进行进一步分析，因为该浓度显著降低了氟康唑对耐药菌株的MIC值。结果显示，CNS处理组的细胞内荧光强度显著高于对照组（图2G和H），表明CNS能够促进Rh6G的积累并抑制其外排。这些结果暗示，CNS与氟康唑的协同抗真菌效果可能与调节药物外排泵活性有关。

在生物膜形态学分析中，我们观察到CNS与氟康唑的联合处理对白念珠菌生物膜的显著抑制作用。SEM图像显示，与空白对照组相比，单独使用CNS或氟康唑的组别均表现出较低的菌丝密度和生物膜结构的破坏，而联合处理组几乎完全抑制了菌丝生长和生物膜形成，仅可见零星的细胞（图3A）。倒置显微镜观察结果与SEM结果一致，空白对照组的生物膜呈现致密的结构，而单独处理组的生物膜较薄，呈单层结构，而联合处理组则仅可见孤立的细胞。通过激光共聚焦显微镜（CLSM）进行的生物膜观察进一步证实了联合处理的显著效果，空白对照组显示强烈的绿色荧光（表示活细胞），而联合处理组则表现出明显的绿色荧光减弱和红色信号增强，表明细胞死亡增加。3D重建图像也支持这些发现，联合处理组的生物膜结构明显受损，与对照组和单独处理组的结构相比呈现出显著的差异（图3B）。

在基因表达分析方面，我们使用qRT-PCR技术评估了与附着和生物膜形成相关的基因（ALS1、ALS3、HWP1和EFG1）的表达水平。所有目标基因在药物处理后均表现出下调趋势。虽然单独使用CNS或氟康唑仅轻微抑制了这些基因的表达，但联合处理显著降低了所有四个基因的表达水平。这一协同转录抑制效应可能与联合处理显著抑制白念珠菌生物膜形成的现象密切相关。

尽管我们的实验结果表明，姜黄素能够调节外排泵活性并增强氟康唑的疗效，但其具体的分子机制，特别是对真菌转运蛋白及相关信号通路的调控，仍需进一步研究。此外，虽然初步实验显示CNS具有良好的稳定性，但其物理和生物特性在长期储存和不同储存条件下仍需严格评估，以确保其药学适用性。同时，通过体外细胞实验和体内动物模型进行全面的生物相容性评估，是验证CNS的安全性和治疗潜力不可或缺的步骤。此外，本研究中采用的真菌复苏和预培养协议，虽然基于已有的方法进行了优化，但涉及特定的温度变化，这可能影响细胞生理特性。因此，这一技术细节在未来的实验中需要进一步验证，以确定其对观察到表型的潜在影响。

总之，本研究证明，CNS能够显著抑制白念珠菌的生长，并增强氟康唑的抗真菌效果。通过SEM和激光共聚焦显微镜的观察，我们确认了CNS与氟康唑在破坏生物膜结构和细胞活性方面的协同效应。机制研究表明，这种协同作用可能源于抑制菌丝发育、损害细胞附着以及阻断外排泵活性。然而，为了全面阐明这种协同抗真菌作用的分子机制，还需要进一步的研究。