泰国食品市场中多重耐药沙门氏菌肠炎的广泛存在：通过对产生ESBL菌株的全基因组分析和表型特征的研究所得到的见解

《Microbiology Spectrum》：High prevalence of multidrug-resistant Salmonella enterica in Thailand food markets: insights from complete genome and phenotypic characterization of ESBL-producing strains

泰国食品中非致病性沙门氏菌耐药性与致病性研究，分离74株从猪肉及发酵食品中，Rissen血清型占比32.43%，52株多重耐药（MDR），4株产ESBL（携带CTX-M-14/55基因）。基因组分析显示染色体介导ESBL菌株侵袭力显著高于质粒介导者，且与环境传播的质粒基因相似性达92%。揭示食源性沙门氏菌耐药基因（如tetA、gyrB）与毒力基因（如csgABCD、ompA）的关联性，凸显泰国作为食品出口和旅游枢纽的公共卫生风险，需加强抗生素管理及耐药监测。

　　在食品供应链中，沙门氏菌的污染是引发食源性疾病暴发的一个常见根源。沙门氏菌在对抗生素耐药性传播方面的影响引起了全球公共卫生的广泛关注。作为东南亚主要的食品出口国和旅游枢纽，泰国尤其容易受到这些问题的影响。为了更深入地了解泰国食品中流行的沙门氏菌种类，我们对之前从泰国食品市场中分离的74株非伤寒沙门氏菌进行了分析，包括全基因组测序、药物敏感性测试和宿主入侵效率实验。研究发现，最常见的沙门氏菌血清型是Rissen（占32.43%），其次是Derby（12.16%）。其中，52株为多重耐药（MDR）菌株，其主要耐药模式为对氨苄西林、链霉素和四环素的耐药性。在所有检测的药物中，最耐药的菌株是Rissen血清型，它对13种药物表现出耐药性，包括第三代头孢菌素。在这些菌株中，有6株被鉴定为头孢菌素酶（ESBL）产生菌株，其中4株携带blaCTX-M-14或blaCTX-M-55等ESBL基因。全基因组分析显示，有3株ESBL产生菌株的耐药性是由质粒介导的，而另一株则是由染色体介导的。与参考菌株沙门氏菌Typhimurium LT2相比，染色体介导的ESBL菌株在体外对粘液产生的人类结肠腺癌HT29-MTX-E12细胞的入侵效率显著更高。有趣的是，本次研究中发现的ESBL质粒与之前从泰国患者中分离出的质粒具有高度相似性。本研究强调了泰国食品中大多数沙门氏菌是多重耐药且可能产生ESBL的菌株，突显了持续监测和干预策略的重要性。

在泰国，发酵食品通常生食，而猪肉被视为泰国菜肴中的珍品。这些食品中存在多重耐药的食源性病原体对公共卫生构成威胁。本研究发现，Rissen血清型是泰国食品样本中最常见的分离株。所有分离株都携带对致病至关重要的毒力基因簇，超过70%的菌株是多重耐药的。其中，4株被确认为ESBL产生菌株。全基因组序列分析和表型特征表明，染色体介导的ESBL菌株在体外对宿主细胞的入侵能力比质粒介导的ESBL菌株更强。本研究揭示了两个重要的公共卫生风险：从未煮熟的食物中获得难以治疗的多重耐药沙门氏菌感染的风险，以及在泰国新鲜市场中耐药质粒的传播。

非伤寒沙门氏菌（NTS）血清型在自然界中广泛存在，具有广泛的宿主范围。2006年的数据估计，东南亚地区每年有约2280万例NTS胃肠道感染病例，其中37600例死亡。多重耐药沙门氏菌对公共卫生构成严重负担，其感染会导致疾病严重程度增加，尤其是免疫功能受损的患者，可能导致长期住院、治疗复杂性和失败，甚至死亡。近年来，产生扩展谱β-内酰胺酶（ESBL）的沙门氏菌出现，使得对青霉素类药物，包括第三代和第四代头孢菌素的耐药性增加。此外，ESBL沙门氏菌可以通过水平基因转移在相同食品基质中传播其耐药基因。多重耐药沙门氏菌的增加对人类健康构成重大风险，并对医疗系统造成负担。为了帮助优先研究和开发对抗耐药性的策略，世界卫生组织（WHO）已将沙门氏菌列为高优先级病原体。

全球范围内，沙门氏菌Enteritidis和Typhimurium是最常见且广泛分布的血清型。然而，在泰国，由于单相变异血清型（如S. 4,[5],12:i:-）的增加，目前S. Typhimurium并未列在与人类临床疾病相关的前五种NTS血清型中。尽管S. Enteritidis和S. Typhimurium在世界范围内是主要致病血清型，但S. Rissen在泰国的猪肉零售和猪肉产品中表现出较高的流行率。过去十年，S. Rissen的多重耐药特性及其在环境和动物中的持久性已被记录。此外，S. Rissen在人体巨噬细胞中的内源性复制能力比在小鼠巨噬细胞中更强，这表明其对宿主的适应性更强。S. Rissen在泰国以外的国家，如中国，也被发现与儿童腹泻有关。

本研究中，74株沙门氏菌是从100个食品样本中分离的，包括生猪肉、发酵猪肉香肠、发酵鱼类和发酵鱼内脏。这些样本来自泰国的五个不同地区。其中，59株来自38个生猪肉样本，15株来自11个发酵食品样本。在发酵食品样本中，12株来自8个发酵猪肉香肠，3株来自3个发酵鱼样本。对所有分离株进行了全基因组测序和分析。通过SeqSero2和多基因位点序列分型（MLST）分析，发现了19种不同的血清型和19种序列类型（STs），每种血清型与一个ST相关。最常见的血清型是Rissen（24/74，32.43%），其次是Derby（9/74，12.16%）、Stanley（5/74，6.76%）、4,[5],12:i:-和Kedougou（各4/74，5.41%），以及Anatum、Bovismorbificans、Hvittingfoss、Krefeld、Tananarive或Brunei和Weltevreden（各3/74，4.05%）。Rissen血清型在两种食品样本中都表现出最高的流行率，这与之前在猪生产链和市场中发现的Rissen血清型流行率一致。

基于三种耐药性数据库，本研究共鉴定出56种耐药性基因，如图2和表S3所示。检测到的基因使这些菌株对15类抗生素产生耐药性，并且一个外排泵基因。所有菌株都携带aac(6')-Iaa基因，该基因编码氨基糖苷修饰酶。72株沙门氏菌（97.30%）携带gyrB基因，该基因编码DNA回旋酶亚基B，赋予对氟喹诺酮类药物的耐药性。此外，许多菌株携带与氨基糖苷类、氟喹诺酮类、氨基环酮类、氟霉素类和巴氏霉素类抗生素耐药相关的基因，占95.95%的样本。在β-内酰胺酶类中，blaTEM-1基因出现频率最高（44/74，59.46%），而blaCMY-2（3/74，4.05%）、blaCTX-M-14和blaCTX-M-55（各2/74，2.70%）则较为少见。磺胺类耐药基因folP在70株（94.59%）中被发现。此外，tet(A)是本研究中最常见的四环素耐药基因，出现在46株中。幸运的是，本研究中未检测到mcr基因，该基因与粘菌素耐药性有关。

通过计算机模拟的质粒分型，检测到了17种质粒复制子类型（见表S4）。52株菌株携带至少一个质粒，其中大多数携带Col(pHAD28)（36/74，48.65%）。第二常见的质粒类型是Col440I（11/74，14.86%）。S. Derby菌株PP14-08和PP14-31携带了最多的质粒，包括Col(pHAD28)、IncFIA(HI1)、IncHI1A和IncHI1B(R27)。然而，血清型与检测到的质粒复制子之间没有相关性。此外，22株菌株无法与数据库中的已知质粒类型匹配。

移动遗传元件（MGE）检测显示，所有菌株都携带MITEEc1这一微型倒置重复转座子（MITE），并且检测到34种不同的MGE类型（见图S2和表S5）。大多数Rissen菌株共享基因组元素，包括插入序列（IS）IS Ecl10、IS Kpn2和MITEEc1。一半的菌株还携带IS26，该插入序列与耐药性基因有关。大多数Derby菌株共享相同的MGE谱型，包括IS Ecl10、IS Kpn26、IS26、cn_5129_IS Vsa3（复合转座子）、IS Vsa3、IS630和MITEEc1。少数血清型携带转座子，如Stanley、Krefeld和Rissen。

基于Virulence Factor Database（VFDB）数据库，本研究共检测到110种毒力基因。这些基因的性质被预测，并且毒力基因模式如图3所示。所有研究菌株都携带了与粘附、趋化性、铁摄取和III型分泌系统（T3SS）相关的毒力基因。一些毒力基因在特定血清型中存在或缺失。例如，faeE基因仅在Anatum和Hvittingfoss血清型中被发现，而fepG基因仅在Stanley血清型中被检测到。相比之下，sifA基因在所有菌株中存在，除了Corvallis和Derby血清型，而avrA基因在Amsterdam和Bovismorbificans血清型中缺失。

根据沙门氏菌毒力岛（SPI）检测，共检测到8个SPIs，包括C63PI和CS54（见表S7）。所有菌株都携带SPI-1、SPI-2、SPI-3和SPI-5。这一发现与毒力基因结果一致，因为这些SPIs包含T3SS基因、镁摄取基因mgtBC和在SPI-5中发现的sopB基因（磷脂酰肌醇磷酸酶基因，用于细胞内生存）和pipB基因（T3SS）。然而，SPI-8仅在Krefeld、Kedougou和Rissen血清型中被发现。C63PI在大多数血清型中存在，除了Amsterdam和Weltevreden血清型。相反，只有预测的Tananarive或Brunei血清型携带CS54岛。

对菌株的抗生素敏感性测试显示，所有菌株至少对一种药物表现出耐药性。令人惊讶的是，70%的菌株为多重耐药菌株，主要耐药模式为对氨苄西林、链霉素和四环素的耐药性，占MDR菌株的86.54%。根据测试药物，我们的菌株在链霉素耐药性（70/74，94.59%）方面表现出趋势，这与基因型结果一致，即73/74株携带氨基糖苷类耐药基因。其次是氨苄西林（51/74，68.92%）、环丙沙星（50/74，67.57%）、四环素（47/74，63.51%）和阿米卡星（46/74，62.16%）。此外，有7株菌株对头孢曲松或头孢他啶表现出耐药性，这些菌株均来自生猪肉样本。其中，4株被确认为ESBL产生菌株，包括PP14-02（S. Corvallis）、PP14-08（S. Derby）、PP14-31（S. Derby）和PP14-54（S. Uganda）。然而，最耐药的菌株是PP14-32和PP14-35，它们均为Rissen血清型，对13到18种药物表现出耐药性，但它们不是ESBL产生菌株。本研究中未发现任何菌株对碳青霉烯类药物表现出耐药性。

通过分析抗生素耐药基因和毒力基因与表型耐药性之间的相关性，我们发现tet(A)基因与四环素和氨苄西林耐药性之间存在显著的强正相关。floR基因与氯霉素耐药性相关。qnrS1基因与环丙沙星耐药性显著正相关，而aadA2、dfrA12、sul3、cmlA1和qacE基因与磺胺甲恶唑-甲氧苄啶耐药性正相关。头孢他啶-头孢他定-头孢曲松-亚胺培南耐药模式显示出强烈的正相关。blaCTX-M-55基因与氨基糖苷类耐药基因（aac (3)-IIc、aac (3)-Iie和aadA22）以及诺氟沙星耐药表型正相关。此外，blaCTX-M-55基因与catA2（氯霉素耐药基因）之间也存在显著的正相关。在毒力基因与耐药性表型的相关性方面，我们发现shdA基因与诺氟沙星耐药性存在显著的强正相关。同时，sseI/srfH基因与链霉素耐药性之间存在负相关。所有这些发现的P值均小于0.01，具有统计学意义。除了ESBL与第三代头孢菌素类药物耐药性之间的正相关外，未发现其他耐药基因或毒力基因与表型之间的直接相关性。

通过全基因组测序和混合组装，我们获得了四个ESBL产生菌株的完整基因组信息（见表S10和图4）。每个菌株包含一个环状染色体和至少一个环状质粒。根据注释结果，大多数耐药基因位于质粒中，除了PP14-54，其所有耐药基因位于染色体中。所有ESBL质粒的大小均超过100 kb，包含复制子和插入序列。以pPP14-02-1为例，该质粒与从泰国患者中分离出的pH1-012质粒相似度为92%。PP14-02和H1-012菌株均携带blaCTX-M-55基因和IncC质粒，这表明这种质粒在泰国环境中广泛传播。对于pPP14-08-1和pPP14-31-1，blaCTX-M-14基因位于IncFIA(HI1)质粒中，并被许多插入序列包围，包括其他耐药基因，这表明该耐药质粒的可移动性。S. Derby菌株PP14-08和PP14-31分别来自泰国的不同地区，这表明该血清型中存在共同的质粒。

我们进一步研究了四个ESBL产生菌株在HT29-MTX-E12细胞中的细胞内感染效率。通过计算回收细菌与接种细菌的对数比，与参考菌株沙门氏菌Typhimurium LT2进行比较。较低的值表明较高的入侵效率。如图5所示，S. strain PP14-54在细胞内的入侵能力比LT2更高（P < 0.01），而S. strain PP14-02的入侵效率显著低于LT2（P < 0.001）。然而，PP14-08和PP14-31的入侵效率与LT2无显著差异。PP14-54的ESBL基因位于其染色体区域，而PP14-02则携带三个包含ESBL的质粒。携带质粒的菌株可能因质粒维持的适应成本而降低其入侵人类细胞和进行细胞内复制的能力，尤其是在无抗生素的情况下。

在泰国，多重耐药沙门氏菌的出现对公共卫生构成严重威胁，尤其是对易感人群，这些人群更容易感染并出现并发症。这种耐药性的出现与住院时间延长、治疗成本增加和有限的治疗选择有关。多重耐药细菌的出现主要由动物和人类中抗生素的滥用驱动。这种做法在环境中施加压力，从而选择出耐药菌株。为应对这一问题，泰国于2007年推出了抗生素智能使用计划，旨在促进抗生素的合理使用，并阻止其用于非细菌感染。然而，挑战依然存在，因为抗生素仍可通过非处方方式轻易获得，且缺乏有效的处方审核资源和能力。需要强有力的政治承诺，以减少医疗专业人员的抗生素滥用，并确保所有医疗机构遵循ASU治疗指南。

总体而言，本研究发现，质粒介导的ESBL菌株中的耐药基因被插入序列包围，这表明在相同食品环境中，这些MDR质粒可能通过水平基因转移在细菌之间传播。作为一个依赖食品生产和出口的国家，本研究旨在提高对食品动物中抗生素使用限制和环境及垃圾场中药物溢出的意识。通过全基因组测序和混合组装，我们获得了这些ESBL产生菌株的完整基因组信息，并对其质粒结构和染色体进行了可视化。此外，我们还对这些菌株进行了毒力基因预测和抗生素耐药性分析，以揭示其在人类肠道细胞中的感染潜力。研究结果强调了在食品环境中监测和控制多重耐药沙门氏菌的重要性，并为制定有效的公共卫生干预策略提供了科学依据。