蜜蜂授粉通过调控激素信号与PoFAR2基因表达提升凤丹牡丹结实率的生理分子机制研究

《Horticulture Research》：Bee-mediated pollination enhances fruit set and seed yield in Paeonia ostii ‘Fengdan’: insights into physiological and molecular mechanisms

本研究针对油用牡丹"凤丹"结实率低的产业难题，通过多组学技术解析蜜蜂授粉提升受精效率的机制。发现蜜蜂传递的高活力花粉能快速激活柱头中ZR、IAA、GA3等内源激素信号，促进花粉管生长；首次鉴定到细胞膜定位基因PoFAR2（脂肪酸酰基辅酶A还原酶2），其通过调控花粉外壁形成显著影响花粉活力。该研究为作物授粉效率提升提供了新靶点。

　　

牡丹被誉为"花中之王"，其籽油富含超过90%的不饱和脂肪酸和40%的α-亚麻酸，具有重要的营养保健价值。然而，作为主要油用牡丹品种的"凤丹"(Paeonia ostii 'Fengdan')却面临着严重的结实困境——自然条件下自花授粉结实率极低，严重制约了产业发展。这背后隐藏着怎样的生物学奥秘？蜜蜂在传粉过程中究竟扮演了怎样的角色？这些问题一直困扰着研究者。

传统观点认为，蜜蜂授粉主要通过增加柱头花粉沉积量来提高作物产量。但有趣的是，河南科技大学研究团队在实验中发现了一个反常现象：人工自花授粉的柱头花粉沉积量(119879.33±43037.92粒)反而显著高于蜜蜂授粉(95464.60±3985.01粒)，但蜜蜂授粉的结实率(55.21%±1.84%)却是人工自花授粉的两倍以上。这一矛盾现象提示我们，蜜蜂授粉的优势可能不仅在于花粉数量，更关键在于花粉质量和其引发的特殊生理响应。

为了揭开这一谜团，研究人员开展了一项集形态学、生理生化和分子生物学于一体的系统研究。他们设计了五种授粉处理方式：蜜蜂授粉(BP)、人工授粉(Hand)、自然授粉(Nature)、风媒授粉(Wind)和人工自花授粉(SP)，通过扫描电镜、荧光显微观察、内源激素检测和转录组测序等技术，深入解析了蜜蜂授粉促进"凤丹"受精的深层机制。

关键技术方法包括：在河南洛阳东牡丹园建立可控网室进行不同授粉处理；通过扫描电镜观察柱头形态和花粉附着；利用荧光显微镜追踪花粉管生长动态；采用HPLC-MS/MS检测ZR、IAA、GA₃、ABA等内源激素；基于Illumina NovaSeq平台进行45个柱头样本的转录组测序；通过病毒诱导基因沉默(VIGS)验证PoFAR2基因功能。

蜜蜂授粉改善油用牡丹柱头花粉质量

研究发现，蜜蜂在访花过程中表现出高度的选择性，它们倾向于采集活力更高的花粉，这些优质花粉被高效地传递到可授期柱头上。虽然人工自花授粉在柱头上沉积了更多花粉，但这些花粉质量较差，导致实际受精效率低下。蜜蜂的梳理行为在连续访花过程中增强了其携带花粉的能力，提高了柱头花粉的多样性和质量，从而促进更充分的受精过程。

扫描电镜和荧光成像观察蜜蜂授粉后油用牡丹雌蕊组织

通过扫描电镜观察发现，油用牡丹柱头具有特殊的"鸡冠状"形态，由两个对称融合的裂片向外弯曲呈耳状，以增加授粉表面积。柱头表面有一个约1毫米宽的明显授粉带，上面覆盖着密集排列的乳突细胞，负责接收花粉粒。比较分析显示，蜜蜂授粉和人工自花授粉的柱头乳突结构没有差异，附着在授粉带上的花粉粒大小或表面纹饰(细网状图案)也没有变化。

荧光显微镜观察揭示了关键时间动态：蜜蜂授粉后0.5小时，柱头上就开始发生花粉萌发，而人工自花授粉此时未见花粉萌发。授粉后1小时，蜜蜂授粉柱头上大量花粉粒萌发，而自花授粉柱头上罕见伸长的花粉管。授粉后2小时，许多蜜蜂授粉的花粉管已穿透花柱，而人工自花授粉的花粉管刚开始伸长，且蜜蜂授粉的花粉管数量明显更多。

授粉后不同时间点油用牡丹雌蕊组织内源激素比值变化

基于荧光显微镜观察结果，研究人员进一步分析了授粉后不同时间点的内源激素比值变化。蜜蜂授粉后，内源激素比值呈现一致的变化趋势，出现两个峰值(BP1和BP24)。ZR/ABA(BP1:0.06±0.002 ng/g)、IAA/ABA(BP1:0.49±0.01 ng/g)、GA₃/ABA(BP1:0.004±0.0001 ng/g)和(IAA+ZR+GA₃)/ABA(BP1:0.55±0.01 ng/g)均在授粉后1小时达到峰值。相比之下，人工自花授粉呈现不同的趋势：ZR/ABA出现两个峰值(SP4:0.09±0.002 ng/g和SP₄₈:0.11±0.001 ng/g)，而IAA/ABA(SP₂:0.97±0.02 ng/g)、GA₃/ABA(SP₄₈:0.08±0.001 ng/g)和(IAA+ZR+GA₃)/ABA(SP₂:1.001±0.02 ng/g)仅出现一个峰值。与未授粉对照相比，蜜蜂授粉后1小时内内源激素比值升高，而人工自花授粉后内源激素比值先下降，2小时后才开始上升。

油用牡丹授粉雌蕊转录组数据的全局分析

研究人员从油用牡丹的自花授粉、蜜蜂授粉和未授粉对照的雌蕊组织中收集了45个cDNA文库进行转录组测序。获得总共305.72 Gb的清洁数据，每个样本产量≥5.86 Gb，Q30碱基百分比≥92.38%。与未授粉组相比，BP组鉴定出1558个差异表达基因(DEGs)，显著富集在萜类代谢过程(GO:0006722)和MAPK信号通路(ko04010)等。SP组与NP组比较发现2831个DEGs，主要富集在次级代谢过程(GO:0019748)和内质网蛋白质加工(ko04141)等。

为进一步研究油用牡丹授粉和受精相关的DEGs，在蜜蜂授粉过程中鉴定出26个交叉DEGs，这些基因显著富集在对脂质(GO:0033993)、化学物质(GO:0042221)和激素(GO:0009725)的响应中。荧光显微镜观察显示授粉后2小时是油用牡丹授粉受精的关键时期，此时BP2组与SP2组比较鉴定出1407个DEGs，包括600个上调基因和807个下调基因，这些DEGs显著富集在内质网蛋白质加工(ko04141)、雌激素信号通路(ko04915)等通路。

差异基因表达趋势分析

对BP组DEGs进行聚类、表达趋势和GO富集分析，基于表达模式将DEGs分为8个簇。其中，1095个在BP2显著上调的DEGs被分配到簇4，这些基因主要富集在木聚糖代谢过程(GO:0045491)、植物型次生细胞壁生物发生(GO:0009834)、植物型细胞壁生物发生(GO:0009832)、苯丙烷代谢过程(GO:0009698)、脂肪酸衍生物代谢过程(GO:1901568)、脂质代谢过程(GO:0046486)和脂肪酰基辅酶A代谢过程(GO:0035336)。

转录组数据验证和表达模式

在授粉后2小时，鉴定出21个可能参与授粉受精的高表达DEGs进行荧光定量分析。值得注意的是，研究人员重点关注了簇4中的Pos.gene.78836，这是一个与拟南芥FAR2(脂肪酸酰基辅酶A还原酶2)同源的基因，该基因通过介导花粉壁形成对花粉外壁模式形成至关重要。该基因从蜜蜂授粉后的油用牡丹雌蕊组织中克隆，命名为PoFAR2。

PoFAR2在雌蕊组织中的表达在蜜蜂授粉后0、1、2、4小时先升高后降低，在BP2时表达显著升高。为探索PoFAR2功能，研究人员构建了35S-PoFAR2-GFP融合表达载体，35S-GFP空载体作为阴性对照。35S-PoFAR2-GFP的荧光信号定位于细胞膜，与预测的膜定位一致，而阴性对照中的GFP信号在细胞核和细胞膜中均观察到。同时，还通过用携带PoFAR2启动子的农杆菌浸润烟草叶片评估了PoFAR2启动子活性。

沉默PoFAR2破坏牡丹花粉发育

利用病毒诱导基因沉默(VIGS)技术，在"凤丹"中抑制了PoFAR2表达。扫描电镜(SEM)显示明显的形态差异：对照花粉显示60%±1.65%正常发育，这些花粉粒为长球形或球形，具三沟孔，外壁具网状纹饰。PoFAR2沉默花粉表现出68.84%±2.27%的异常率，花粉粒显示畸形沟孔、不规则轮廓和异常卷曲/塌陷。

为确定这些缺陷是否导致花粉败育，进行了TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)染色。对照显示高活力：61.01%±2.33%染成深红色。相反，只有27.36%±2.30%的PoFAR2沉默花粉染成浅红色，罕见红色花粉粒。未染色比例与发育异常率相符。因此，PoFAR2沉默损害花粉壁形成，严重损害花粉活力。

蜜蜂授粉促进更多花粉萌发和花粉管生长

柱头花粉沉积量与花粉管生长和结实等生理过程密切相关。较高的花粉沉积量增加了植物成功受精的概率，并促进子房的早期发育。本研究中，蜜蜂授粉的柱头花粉沉积量低于人工自花授粉，但实现了更高的花粉萌发率和更快的花粉管生长。这可归因于几个因素：首先，油用牡丹作为部分自交亲和的异花授粉植物，受益于蜜蜂传递的高质量花粉；其次，增加的外源花粉沉积刺激花柱中更多花粉管，它们的竞争加速了花粉管生长；第三，多次传粉者访问通常启动能够胚珠受精的花粉管生长，增强果实和种子产量。

蜜蜂授粉促进内源激素比值更快达到峰值

授粉作为一种外源刺激，诱导雌蕊组织中酶活性和激素水平的变化，与花粉萌发和花粉管生长密切相关。特定浓度的IAA和GA₃促进体外花粉萌发和花粉管生长，而ABA抑制花粉萌发但对花粉管生长有一定促进作用。在杂交授粉研究中，高水平的IAA、GA₃、ABA和ZR支持花粉管生长，平衡的比值(如GA₃/ABA、IAA/ABA、IAA/ZR、ZR/ABA和(GA₃+ZR+IAA)/ABA)反映授粉亲和性。荧光观察显示蜜蜂授粉后1小时花粉快速萌发和花粉管生长，而人工自花授粉将这些过程延迟了2小时。与未授粉对照(0小时)相比，蜜蜂授粉后1小时内源激素比值升高并超过人工自花授粉，表明IAA、GA₃、ABA和ZR共同促进花粉萌发和管生长。相比之下，人工自花授粉最初降低激素比值，授粉后2小时开始上升，而ABA抑制花粉萌发。这些发现强调了平衡激素比值在调节花粉萌发和花粉管生长中的重要性，并间接表明蜜蜂授粉向油用牡丹柱头传递高亲和力花粉，刺激内源生长调节剂并增强花粉萌发和花粉管生长。

鉴定与花粉发育相关的关键候选基因

授粉和受精过程涉及多基因调控网络。本研究分析了油用牡丹蜜蜂授粉和人工自花授粉过程中的基因表达，鉴定出68880个基因。其中，21个和26个交叉DEGs分别独特于人工自花授粉和蜜蜂授粉。蜜蜂授粉DEGs主要富集在植物激素信号转导(ko04075)、植物昼夜节律(ko04712)、内质网蛋白质加工(ko04141)和内吞作用(ko04144)等通路，与甜樱花粉管lncRNAs中的发现一致。授粉后1-6小时的时间窗口是花粉管发育、品种间花粉管竞争和柱头变化的关键时期。聚焦授粉后2小时，在簇4中鉴定出PoFAR2，这是一个参与以下通路的关注基因：脂质代谢过程(GO:0006629)、细胞组分：膜整合组分(GO:0016021)、跨膜转运活性(GO:0022857)、脂肪酰基辅酶A还原酶(醇形成)活性(GO:0080019)、醇形成脂肪酰基辅酶A还原酶(ko13356)以及角质、木栓质和蜡质生物合成(ko00073)。

PoFAR2沉默后，花粉粒呈现畸形沟孔、不规则轮廓和异常卷曲/塌陷。值得注意的是，在陆地棉中观察到功能保守性，CRISPR/Cas9介导的GhFAR2敲除导致完全雄性不育，表现为无粉花药异常萎缩，进一步证实了FAR2在真双子叶植物花粉发育中的重要作用。PoFAR2与拟南芥FAR2高度同源，其中AtMS2/FAR2对孢子(花粉)外壁发育至关重要。花粉壁是围绕雄配子体的致密层，对花粉粒完整性至关重要。在花药发育过程中，花粉粒中花粉壁沉积是最关键的事件之一。其缺失可能阻碍花粉发育，导致花粉退化。PoFAR2被注释为具有脂肪酰基辅酶A还原酶(醇形成)活性，脂肪酰基辅酶A也对其前体花粉素至关重要。脂肪酰基辅酶A合成酶对花粉发育和花粉素生物合成至关重要。OsDPW编码一个与拟南芥MS2基因高度同源的脂肪酰基辅酶A还原酶。该基因参与水稻花药绒毡层细胞内的营养合成。OsDPW突变导致绒毡层质体增加、Ubisch体产生减少、花粉外壁发育异常和小孢子退化。在本研究中，PoFAR2沉默同样导致"凤丹"花粉发育异常。该基因在"凤丹"花粉发育中的作用需要进一步的机制研究。

预测和实验证实的PoFAR2亚细胞定位于细胞膜，表明其在膜相关过程中潜在作用，如脂质代谢或信号转导。也有研究报道其他花粉发育相关FARs，如AtMS2/FAR、OsDPW和ZmMs25，定位于质体被膜。PoFAR2启动子分析揭示赤霉素响应元件(TATC-box)，与GA₃在授粉受精中的作用一致。以及茉莉酸甲酯响应元件(CGTCA-motif)。这些发现表明PoFAR2可能整合赤霉素和茉莉酸信号通路。茉莉酸(JA)介导植物对温度胁迫的响应，JA合成中断可能导致花粉发育异常和花药不开裂。此外，启动子中的光响应元件(如GATA-motif)暗示PoFAR2可能将环境线索(如光)整合到细胞响应中。总之，这些发现表明PoFAR2在细胞膜上发挥作用，介导花粉发育过程中的激素和环境信号转导。

此外，BP2中鉴定的基因Pos.gene10432与拟南芥GLIP2高度同源，后者调节IAA表达并促进花粉管生长。Pos.gene53484与拟南芥FLS1高度同源，编码黄烷醇合酶，催化二氢黄酮醇产生黄烷醇。黄烷醇通过调节高温胁迫下的ROS稳态维持花粉管生长和完整性，这一过程对花粉萌发至关重要。Pos.gene63925与拟南芥WSD1同源，是一种参与蜡合成的蜡合酶/酰基转移酶。植物蜡是雌蕊表面的疏水层，促进花粉-柱头信号识别。SP2中，Pos.gene56312与拟南芥ABI5同源，该基因参与ABA调节表达。由于ABA抑制雌蕊花粉管，需要进一步研究和验证Pos.gene56312是否调节油用牡丹花粉管生长。

本研究证实蜜蜂授粉通过提供充足高质量花粉提高授粉效率，导致结实率增加。它促进柱头上更多花粉萌发和管生长，同时刺激雌蕊组织中内源激素更有效作用。值得注意的是，这项工作首次将蜜蜂授粉技术与油用牡丹转录组测序相结合。通过差异基因表达分析，鉴定出PoFAR2作为花粉发育相关的关键候选基因，定位于细胞膜并表现出强启动子活性。其表达可能受GA₃和茉莉酸信号调节。沉默PoFAR2破坏花粉发育(如花粉壁结构缺陷)并降低"凤丹"花粉活力。尽管PoFAR2的精确调控机制需要进一步研究，但我们的发现揭示了涉及蜜蜂授粉、植物激素和花粉成熟的更广泛信号网络。阐明蜜蜂、激素(特别是GA₃和茉莉酸)和花粉发育之间的三方相互作用至关重要。该研究为提高油用牡丹育种效率和推进作物授粉系统生态管理策略提供了关键理论见解。