一种基于3A蛋白的新型间接酶联免疫吸附测定法，用于Senecavirus A的血清学检测

《Microbiology Spectrum》：A novel 3A-based indirect enzyme-linked immunosorbent assay for serological testing of Senecavirus A

Senecavirus A (SVA)血清学检测新方法：基于3A蛋白的间接ELISA灵敏度高、特异性强，与IFA一致性达100%，优于现有商业试剂盒。

　　Senecavirus A（SVA），又称塞纳谷病毒，是一种影响猪群的重要病原体，其引发的疾病在临床上表现出明显的症状，如口部和蹄部出现水疱病变。这些症状与口蹄疫（FMD）、猪水疱病（SVD）以及口蹄溃疡病（VS）非常相似，这使得SVA的临床诊断变得极为困难。由于SVA对不同年龄阶段的猪都有感染能力，尤其是新生仔猪，其感染后的临床表现包括虚弱、食欲不振、腹泻、突发死亡等，死亡率高达70%至80%。这种高致死率和广泛传播性对全球的养猪业造成了巨大的经济损失。

目前，针对SVA的检测方法主要包括病毒中和试验（VNT）、间接免疫荧光分析（IFA）、聚合酶链式反应（PCR）、等温扩增技术（LAMP）以及酶联免疫吸附测定（ELISA）。尽管这些方法各有优劣，但其中VNT和IFA常被视为检测SVA的“金标准”，它们虽然在检测灵敏度上表现出色，但操作复杂且耗时较长，限制了其在实际应用中的普及。PCR和LAMP虽然具有极高的灵敏度，但其依赖昂贵的设备和严格的实验条件，增加了实际操作的成本和技术门槛。相比之下，ELISA因其操作简便、快速且检测通量高，被认为是一种更适用于大规模检测的工具。然而，现有的ELISA检测方法在选择不同的病毒蛋白作为抗原时，存在一定的局限性，例如交叉反应等问题，这影响了其检测的准确性和特异性。

因此，建立一种高效、特异性强且适用于长期监测的SVA ELISA检测方法具有重要意义。在本研究中，科学家们基于SVA的非结构蛋白3A开发了一种新的间接ELISA方法。与传统的商业ELISA试剂盒相比，该方法表现出更高的灵敏度和更好的特异性。研究结果显示，新方法的灵敏度达到了1:4096，远高于商业试剂盒的1:32。此外，该方法在检测过程中没有与其它猪病病毒如猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、经典猪瘟病毒（CSFV）、猪圆环病毒2型（PCV2）、伪狂犬病毒（PRV）、猪肠病毒（PAstV）、非洲猪瘟病毒（ASFV）以及猪流行性腹泻病毒（PEDV）的阳性血清样本发生交叉反应，表明其具有良好的特异性。

为了验证新方法的稳定性和重复性，研究者们进行了多次实验。结果显示，无论是同一批次还是不同批次的实验，该ELISA方法的变异系数均低于10%，说明其在重复性和稳定性方面表现优异。此外，通过在4°C条件下储存并每隔10天进行测试，发现该方法在至少90天内仍能保持稳定，这为长期的疾病监测提供了可靠的基础。

在实际临床应用中，研究团队使用新建立的间接ELISA方法与商业试剂盒及IFA并行检测了173份临床血清样本。结果显示，间接ELISA的符合率达到了100%，而商业试剂盒的符合率仅为89.60%。这一结果表明，基于3A蛋白的间接ELISA在检测SVA抗体方面具有更高的准确性和可靠性，能够有效区分感染和疫苗接种的动物，这在当前没有商业疫苗的情况下尤为重要。

此外，研究团队还对ELISA方法的各个步骤进行了优化，包括抗原包被浓度、血清稀释比例、阻断剂的选择、抗体稀释比例以及显色时间等。通过系统的实验设计和多次重复测试，确定了最优的检测条件，从而确保了检测结果的准确性和可重复性。这种优化过程不仅提高了检测效率，还降低了实验误差，使得该方法在实际应用中更加可靠。

基于3A蛋白的间接ELISA方法在实际应用中展现出显著的优势。它不仅能够有效检测SVA感染，还避免了与其它猪病病毒的交叉反应，提高了检测的特异性。同时，该方法的操作流程简单，适合在常规实验室中进行大规模检测，有助于提高疾病监测的效率。对于缺乏商业疫苗的SVA，这种高效的检测方法能够为疾病防控提供有力支持，帮助养殖者及时发现感染情况，采取相应的措施以减少经济损失。

研究团队还对方法的重复性和稳定性进行了详细评估。通过分析同一批次和不同批次的实验数据，发现该方法的变异系数均低于10%，说明其具有良好的重复性。同时，在90天的稳定性测试中，无论是SVA阳性血清样本还是阴性样本，其检测结果均保持稳定，进一步证明了该方法的可靠性。这些数据表明，基于3A蛋白的间接ELISA不仅适用于短期的疾病检测，还能够支持长期的疾病监测和防控工作。

在实际应用中，该方法已被证明能够与IFA和商业试剂盒保持一致的检测结果，为疾病诊断提供了另一种有效的选择。考虑到SVA感染的复杂性和对养殖业的影响，建立一种高效、准确且稳定的检测方法对于疾病防控具有重要意义。该研究不仅为SVA的诊断提供了新的工具，还为相关疫苗研发提供了潜在的方向。通过使用非结构蛋白作为抗原，研究人员能够更准确地区分感染和疫苗接种的动物，这在疫苗接种率较高的情况下尤为重要。

综上所述，基于SVA 3A非结构蛋白的间接ELISA方法在检测灵敏度、特异性、重复性和稳定性方面均表现出色，为SVA的临床诊断和长期监测提供了可靠的技术支持。该方法的建立不仅有助于提高疾病防控效率，也为相关研究提供了新的思路和方向。随着对SVA研究的深入，未来可能会有更多基于非结构蛋白的检测方法被开发出来，为猪病防控提供更加全面和高效的解决方案。