利用一种具有差异荧光报告基因的质粒来分析Teg41和PSMα启动子的活性

《mSphere》：Analysis of Teg41 and PSMα promoter activity using a divergent fluorescent reporter plasmid

金黄色葡萄球菌中sRNA Teg41调控PSMα毒素启动子的独立表达及环境响应机制研究。通过双荧光报告系统、单细胞流式分析和RNA-seq发现，Teg41启动子活性稳定且与PSMα启动子响应不同刺激（如金属离子、温度、营养限制），揭示两者调控的时空异质性及转录超螺旋耦合可能作用。

　　在人类皮肤和鼻腔中，金黄色葡萄球菌（*Staphylococcus aureus*）是一种常见的共生微生物，但同时也是引发多种疾病的显著病原体。这些疾病范围从轻微的皮肤感染到严重的、甚至可能致命的病症，如败血症、中毒性休克综合征和心内膜炎。随着多药耐药菌株的增加，尤其是社区获得性甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌（CA-MRSA），全球健康界将金黄色葡萄球菌视为重大威胁。为了有效入侵宿主组织，金黄色葡萄球菌需要精确地在时间和空间上调控毒力因子的表达，这一调控过程可以由小RNA（sRNAs）完成。我们实验室在金黄色葡萄球菌USA300株中识别出超过300种潜在的sRNA，强调了它们在基因调控中的重要性。最近，我们的团队表征了一种名为Teg41的sRNA，它能够正向调控PSMα启动子的转录，从而增强毒素产生和毒力。Teg41位于PSMα启动子起始位点下游203个碱基对（bp）的位置，显示出相对稳定的生长阶段表达，这是金黄色葡萄球菌中sRNA的首次发现。我们证明了Teg41和PSMα启动子对不同的刺激做出反应，并且它们的调控区域是不同的。通过单细胞分析，我们发现金黄色葡萄球菌群体中Teg41的表达并非均匀，一部分细胞表现出高水平的表达。这项研究引入了新的工具来研究不同的启动子，并阐明了Teg41与PSMα表达之间的关系。

金黄色葡萄球菌作为主要的病原体，其耐药性问题对公共卫生构成了严重挑战。了解其毒力调控机制对于开发新的治疗策略至关重要。尽管sRNA在细菌基因表达调控中起着关键作用，但大多数sRNA仍未被充分表征。本研究聚焦于Teg41，这是一种激活PSMα毒素表达的sRNA。我们利用一种新的双荧光报告系统和单细胞分析技术，揭示了Teg41及其靶启动子在不同刺激下独立且不均一地调控。这些发现为理解sRNA介导的毒力调控提供了新的见解，并为解析金黄色葡萄球菌复杂的基因调控网络提供了创新工具。

金黄色葡萄球菌的毒力因子表达需要在特定时间和空间条件下进行精确调控。这一调控机制涉及多种蛋白因子，它们通过与启动子区域结合来调控基因表达。此外，细菌基因表达也可以通过RNA机制进行调控，其中小RNA（sRNA）通过与mRNA结合来改变其表达水平。我们实验室在金黄色葡萄球菌USA300株中注释了超过300种潜在的sRNA，这一数量超过了已知的蛋白转录因子。这表明sRNA在金黄色葡萄球菌基因调控中扮演着重要角色。然而，尽管如此，仅有少数sRNA被详细表征，尽管它们在调控毒力中具有基础性作用。

最近，我们的团队描述了一种名为Teg41的sRNA，它控制金黄色葡萄球菌中PSMα毒素的表达和毒力。我们展示了Teg41可以显著激活PSMα启动子，从而增加PSMα毒素的产生。Teg41基因位于PSMα基因起始位点下游203个碱基对处。在本研究中，我们分析了Teg41与PSMα表达之间的关系，以了解其调控条件。我们构建了一种双荧光报告载体pPRB4，使用pMK4骨架载体，将268个碱基对的PSMα-Teg41启动子区域插入到sGFP和mCherry基因之间。由于Teg41启动子缺乏核糖体结合位点，我们在mCherry起始密码子前添加了来自pJB185载体的翻译起始区（TIR）。在TSB中生长的野生型金黄色葡萄球菌AH1263菌株携带pPRB4载体，我们监测了sGFP和mCherry的荧光强度，以及OD600，作为PSMα和Teg41启动子活动的代理指标。最大荧光强度被设定为100%活动。数据以三个重复的平均值±标准差表示。

PSMα启动子在生长的前5小时内保持不活跃，但在晚期指数阶段迅速增加。相比之下，Teg41启动子在前2小时内表现出低表达，随后逐渐增加。我们还观察到Teg41启动子活性在PSMα启动子激活前有一个小的平台期。为了进一步分析表达模式，我们绘制了荧光强度与细菌生长之间的关系。PSMα启动子在细胞密度达到OD600=0.85时激活，而Teg41启动子在整个生长过程中显示出相对连续的活性。这些结果表明，尽管PSMα和Teg41基因位点之间的距离很近，但它们的表达动力学不同：(i) PSMα启动子的表达模式依赖于细胞密度，而Teg41启动子的活性在TSB中相对恒定。

为了评估不同金黄色葡萄球菌背景下的Teg41和PSMα表达情况，我们将双报告载体pPRB4通过噬菌体转导到多种金黄色葡萄球菌菌株中，包括AH1263（蓝）、NCTC-8325（红）、TCH1516（绿）、Newman（紫）、JE2（橙）、COL（黑）、Mu50（棕）和UAMS-1（深蓝）。这些菌株在与AH1263相同的条件下生长。我们通过计算每种菌株的启动子活动，并将其归一化为AH1263的100%来分析启动子活动。所有测试菌株中Teg41启动子的活动没有差异。相比之下，Newman菌株的PSMα启动子活动显著增加（255% vs 115%），而COL、Mu50和UAMS-1菌株中未检测到PSMα启动子活动。为了验证这些发现，我们进行了逆转录定量PCR（RT-qPCR），靶向检测AH1263、Newman（高PSMα表达）和UAMS-1（低PSMα表达）菌株中的Teg41和PSMα。这些菌株在96孔板中以37°C在TSB中培养，并在3或6小时后进行RNA提取和RT-qPCR。结果与PSMα启动子活动记录一致，Newman菌株中PSMα转录水平较高，而UAMS-1菌株中转录水平较低，这也在6小时后得到证实。RT-qPCR数据显示，在UAMS-1菌株中，Teg41 RNA水平较低，这可能是由于该菌株中RNA降解率较高所致。综上所述，上述结果表明Teg41启动子活性和RNA水平在不同金黄色葡萄球菌菌株中基本一致，而PSMα启动子活性和RNA丰度在不同菌株中存在差异。

为了进一步研究Teg41启动子区域中哪些部分对表达是必要的，我们在双报告载体pPRB4中构建了不同长度的截断启动子序列，使用体内组装方法。我们分析了七个不同长度的启动子：P1（25 bp，位于预测的Teg41 TSS相对位置+13 bp），P2（50 bp，位于TSS上游-12 bp），P3（75 bp，位于TSS上游-37 bp），P4（125 bp，位于TSS上游-62 bp），P5（150 bp，位于TSS上游-87 bp），P6（225 bp，位于TSS上游-162 bp），以及全长（FL）原生启动子（268 bp）。在TSB中生长的金黄色葡萄球菌野生型菌株携带这些构建物，我们通过测量mCherry荧光强度并归一化为OD600来评估启动子活性。启动子活性以百分比形式表达，相对于全长启动子设置为100%±SD。P1和P2启动子序列没有活性，而P3、P4、P5和P6启动子序列显示出相似的活性，范围在全长启动子活性的50%到75%之间。只有全长启动子（268 bp）显示出最大活性。这些结果表明，Teg41启动子的近端元素位于P2-P3区域，而潜在的远端元素可能位于P6-全长区域（46 bp，位于PSMα起始密码子下游）。基于5′ RACE分析结果，Teg41的TSS不在P1启动子片段内，P2启动子片段开始于TSS上游7个核苷酸。这可能解释了为什么P1和P2构建物没有转录活性。P3启动子片段显示转录活性，其中包含32个核苷酸位于Teg41 TSS上游，且该序列中存在潜在的-35和-10启动子元件（在图2B中用下划线标出）。因此，我们假设这一区域包含Teg41启动子的核心部分。

为了研究Teg41启动子的调控因子，我们分析了公开的RNA-seq数据，以确定可能影响Teg41表达的转录调控因子。我们首先分析了每个两组分系统（TCS）对Teg41表达的影响。我们使用由磷酸模拟反应调节因子生成的数据，以确定激活个体TCS是否会调节Teg41表达。我们的分析显示，Teg41表达在表达每个金黄色葡萄球菌反应调节因子的活性形式后没有变化。随后，我们继续分析了Teg41表达在公开的转录因子突变体RNA-seq数据中的情况。我们分析了毒素抑制因子rot、替代σ因子sigB和sigS、休眠因子hpf以及金黄色葡萄球菌辅助调节因子sarA，并将突变体与野生型菌株在每种条件下进行比较。分析结果显示，rot（log2 fold change [log2FC] = -4.2）、hpf（log2FC = -2.4）和sarA（log2FC = -2.8）突变体中Teg41表达受到抑制。为了验证这些结果，我们在适当的突变体背景下使用双荧光报告系统监测PSMα和Teg41启动子活动。我们使用了来自内布拉斯州转座子库的突变体，并将其与野生型JE2菌株进行比较。只有hpf突变体降低了PSMα启动子活动，降至野生型菌株的约60%，但并未达到统计学显著水平（P值=0.0862）。任何测试突变体中Teg41启动子活动均未观察到变化。这些结果表明，Teg41转录在我们的条件下未受测试的转录因子调控，而RNA-seq中观察到的Teg41 RNA水平下降可能是由于这些背景下的RNA降解率变化所致。

接下来，我们评估了Teg41和PSMα启动子在感染期间遇到的不同刺激下的活动。我们首先在公开的RNA-seq数据中评估了Teg41表达，并将其与每项实验中的对照条件进行比较。在存在calprotectin（log2FC = -2.1）和尿液（log2FC = -2.0）的条件下，金黄色葡萄球菌显示Teg41表达减少。为了确认并扩展这些调节条件，我们进行了荧光盘扩散实验。简要地说，将携带双荧光报告载体pPRB4的金黄色葡萄球菌野生型菌株培养在含氯霉素的胰蛋白大豆琼脂（TSA）上。然后，将浸有不同刺激的圆盘（如33%过氧化氢用于氧化应激，0.5 M EDTA作为广谱金属螯合剂，64 mM 2,2′-bipyridyl作为铁特异性螯合剂，40 mM TPEN作为锌特异性螯合剂，1 M盐酸和1 M乙酸，以及100 mM铁硫酸或锌硫酸补充，以及水作为对照）放置在琼脂上，并在30°C或37°C下培养过夜。24小时后，测量GFP和mCherry的荧光强度，并将其归一化为OD600（见材料和方法部分的更多细节）。在37°C下，Teg41启动子活性在存在H2O2（54.3%）、EDTA（80.4%）、2,2′-bipyridyl（53.8%）、TPEN（54.9%）和ZnSO4（85.6%）时均降低。然而，Teg41启动子在存在HAc（112.4%）和FeSO4（128.4%）时略有刺激。PSMα启动子的表达模式则不同。H2O2、2,2′-bipyridyl和TPEN均降低了PSMα启动子活性（分别为44.7%、26.7%和66.1%）。类似的结果也出现在Teg41启动子在这些条件下的表现中。相比之下，EDTA显著增加了PSMα启动子活性（228.4%），而ZnSO4显著降低了PSMα启动子活性（5.5%）。值得注意的是，HCl和HAc在这些条件下降低了PSMα启动子活性（分别为27.4%和30.9%），这与Teg41启动子在HAc条件下的反应相反。在30°C下，Teg41启动子活性与37°C下的活性相似。有趣的是，在30°C下，PSMα启动子表现出与37°C相似的活性模式，除了EDTA，它导致活性显著下降（15.4%）。这一条件也表现出比其他刺激更大的变异性。综上所述，这些结果表明：(i) Teg41启动子活性对温度变化没有反应；(ii) Teg41启动子对感染期间遇到的环境刺激表现出一定的活动变化；(iii) PSMα启动子对EDTA的反应依赖于生长温度。

最后，我们评估了在生理相关培养基中，PSMα和Teg41启动子的活性。我们使用了合成囊性纤维化培养基（SCFM）和罗氏公园纪念研究所（RPMI）培养基，这些培养基已被用于模拟囊性纤维化和人血浆中发现的低营养环境。金黄色葡萄球菌在TSB、SCFM或RPMI中培养16小时，37°C下生长，并测量GFP和mCherry的荧光强度和细菌密度（OD600）。启动子活性计算如上所述，并与TSB中的活性进行比较（设定为100%）。有趣的是，PSMα启动子活性在SCFM中显著降低（TSB活性的10.2%），在RPMI中降低到3.1%。而Teg41启动子活性在SCFM中没有显著变化，并在RPMI中增加（155.3%）。我们还绘制了荧光强度与OD600的关系，如TSB中的分析（图1C）。在SCFM中，Teg41和PSMα启动子的活性与OD600呈线性相关，表明这些启动子的活性似乎依赖于生长。在RPMI中，PSMα启动子的活性与细菌生长无关，但Teg41启动子活性仍然与OD600相关。总之，Teg41启动子活性相对恒定，但在感染期间遇到的环境刺激下会表现出一些变化。Teg41启动子活性在营养受限条件下保持稳定或增加，这与PSMα启动子活性不同。

在TSB和RPMI中，金黄色葡萄球菌表现出不同的细胞亚群，这些亚群表现出不同水平的Teg41和PSMα表达。因此，我们进一步使用定量流式细胞术分析了在RPMI中的Teg41和PSMα启动子表达动态。金黄色葡萄球菌野生型菌株携带双荧光报告载体，在TSB或RPMI中培养，并在3小时（对数期）、6小时（晚期对数期）和24小时（晚期稳定期）后通过流式细胞术测量Teg41和PSMα启动子活性。在3小时的RPMI和TSB中，Teg41和PSMα启动子活性均不均匀。金黄色葡萄球菌细胞被分为两个不同的亚群：低PSMα和Teg41启动子活性（在TSB中，40%和34%的细胞；在RPMI中，65%和68%的细胞）和高PSMα和Teg41启动子活性（在TSB中，36%和25%的细胞；在RPMI中，40%和23%的细胞）。有趣的是，在6小时时，两种启动子的活性在TSB和RPMI中均呈现均匀分布，其中TSB中的PSMα启动子活性高于RPMI，而RPMI中的Teg41启动子活性高于TSB。值得注意的是，在TSB中，存在一个极小的亚群（1%）没有PSMα启动子活性。在RPMI中，金黄色葡萄球菌在24小时时表现出启动子活性的异质性。在TSB中，PSMα启动子在24小时时几乎没有活性，但金黄色葡萄球菌在TSB中表现出两个不同的亚群：75%的细胞表现出高水平的PSMα表达，而12%的细胞表现出低或无PSMα表达。对于Teg41启动子，TSB中大多数细胞（61%）表现出高水平的活性，而16%的细胞表现出低至无Teg41活性。在RPMI中，Teg41启动子表现出比TSB更高的活性，其中大多数细胞（86%）的活性高于TSB中观察到的水平。有趣的是，在RPMI中，一个极小的细胞亚群（8%）表现出非常高的Teg41活性（比大部分细胞高8到10倍）。这些结果表明，Teg41和PSMα表达在TSB和RPMI中的表现不同。虽然PSMα在TSB的稳定期表现出强烈的表达，但在RPMI中，PSMα启动子在相同时间点的表达几乎完全被抑制。在TSB和RPMI中观察到的Teg41表达差异也出现在早期（3小时）和晚期（24小时）时间点。此外，这些结果清楚地表明，Teg41和PSMα表达在整个群体中并非均匀。相反，细菌培养物中存在表现出不同基因表达水平的亚群。值得注意的是，当我们比较群体重叠时，我们始终观察到高Teg41表达的细胞也表现出高水平的PSMα表达，而低Teg41表达的细胞表现出较低的PSMα水平。这种模式支持Teg41作为PSMα表达激活因子的潜在作用。这一发现对研究细菌基因表达具有重要意义，并进一步强调了研究个体细胞基因表达的必要性。

RPMI是一种与TSB相比的营养受限培养基，特别是在过渡金属（铁和锌）的可用性方面。在RPMI中，锌和铁的浓度远低于TSB中发现的高浓度（约20 μM铁和8 μM锌）。此外，盘扩散实验显示，铁/锌的耗竭改变了Teg41和PSMα启动子活性的动态。因此，我们研究了向RPMI中添加铁和锌是否会影响Teg41和PSMα的表达以及是否改变观察到的亚群。金黄色葡萄球菌在RPMI中培养，并在存在锌或铁（20 μM）的情况下监测启动子活性，并与在RPMI中单独培养的金黄色葡萄球菌进行比较。对于PSMα启动子，添加锌在3小时时增加了高活性细胞的百分比（从RPMI中的25%增加到RPMI+锌中的44%），但过渡金属在后续时间点没有影响。对于Teg41启动子，3小时时添加锌或铁均增加了高活性细胞的百分比，与PSMα启动子的情况相似。添加铁和特别锌导致的Teg41表达亚群与在TSB中观察到的金黄色葡萄球菌情况类似。在6小时时，添加锌或铁后没有观察到差异，所有细胞表现出均匀的Teg41启动子活性。令人惊讶的是，在24小时时，铁的存在降低了Teg41启动子活性（72%的细胞表现出低水平的Teg41表达），而RPMI或RPMI+锌中的Teg41启动子活性相似。这些数据表明，过渡金属的存在会影响在RPMI中Teg41和PSMα启动子活性的单细胞动态，其中铁和锌在生长初期增加两种启动子的活性，而铁在晚期稳定期对Teg41启动子活性产生负面影响。

我们之前已经证明，Teg41是金黄色葡萄球菌毒力的关键sRNA，因为它控制了多种毒力因子的表达，包括PSMα肽。PSMα基因位点与Teg41之间的短距离促使我们研究这一区域的动态表达。首次在金黄色葡萄球菌中，我们使用双荧光报告系统研究了PSMα和Teg41启动子之间的关系。我们的数据表明，Teg41具有自己的独特启动子，可以以异质方式响应感染期间遇到的各种刺激，细胞表现出不同的启动子活性水平，取决于条件。在TSB中，Teg41启动子表现出组成性表达，其活性与细胞生长相关。相比之下，PSMα启动子的表达仅在细胞达到群体感应时被激活，正如之前所描述的。鉴于PSMα和Teg41启动子之间的短距离（203 bp），它们的表达模式特别有趣。在RPMI和SCFM中，PSMα启动子是不活跃的，而Teg41启动子是活跃的，其活性在RPMI中高于TSB。这种差异值得注意，因为RPMI和SCFM是与TSB相比的营养受限培养基，含有较低的金属、维生素和氨基酸浓度（RPMI）或较低的葡萄糖浓度（SCFM），这表明Teg41启动子在营养受限条件下不会受到不利影响，甚至可能被增强。RPMI中Teg41启动子活性的增加令人着迷，表明其在金黄色葡萄球菌生理学中的作用可能因营养可用性而有所不同。RPMI常用于研究，因为它模拟了人血浆的条件。我们的结果表明，PSMα在血浆样条件下不表达或仅轻微表达，尽管这一点仍需进一步确认。这些发现突显了Teg41在此环境中的潜在关键作用。这些结果与我们之前的研究结果一致，表明Teg41在金黄色葡萄球菌中的作用与调控PSMα生产无关。需要进一步的RNA-seq和蛋白质组学研究来探讨Teg41在RPMI和血浆暴露期间的作用。

在研究Teg41启动子的最小表达区域时，我们确定了启动子上游37个碱基对的区域，该区域通过RACE PCR鉴定。该区域的前15个碱基对包含一个高A/T序列（5′-TAATTATATT-3′），其中包含一个潜在的-10元件（在图2B中用下划线标出）。在位置-37到-25（5′-CATGAA TTTGAG-3′）之间，我们识别出一个潜在的-35元件（同样在图2B中用下划线标出）。有趣的是，在我们实验条件下，将序列延长至位置-162时未观察到额外的启动子活性，这表明该区域的调控元件在我们实验条件下可能不存在。因此，Teg41启动子活性与不同培养基中细胞生长的相关性似乎仅依赖于前37个碱基对，其中包含-10和-35元件，这表明Teg41启动子在金黄色葡萄球菌中相对组成性。

尽管Teg41启动子的近端区域（至-187个碱基对）似乎不影响活性，但远端区域似乎重要。P6启动子片段与全长启动子之间的差异是43个碱基对。该区域包含AgrA结合位点（PSMα表达所必需），而P6中该结合位点被截断。有趣的是，如图3所示，AgrA的缺失不会影响Teg41启动子活性，排除了AgrA对Teg41启动子的调控作用。该43个碱基对区域还包含PSMα操纵子的TSS。可能PSMα启动子的转录活性会影响Teg41启动子活性。我们观察到在群体感应达到前，Teg41活性有一个小的平台期。当PSMα启动子被激活时，Teg41启动子活性恢复。已知DNA拓扑学可以影响不同启动子的转录。转录过程中，RNA聚合酶会生成显著的DNA扭结，这些扭结可能通过称为转录超螺旋耦合（TSC）的机制影响邻近的启动子。Sobetzko的研究表明，在包含两个不同启动子的配置中，其中一个可诱导，非诱导启动子的活性也可能在诱导启动子时增加。在我们的案例中，当群体感应达到时，PSMα启动子被诱导，我们假设TSC刺激了Teg41启动子活性。这创造了一个正反馈回路，其中PSMα操纵子的表达通过TSC刺激Teg41表达。

我们确定了几种可以调节PSMα和Teg41启动子活性的刺激，这证实了其他研究的结果。有趣的是，虽然Teg41启动子活性在37°C和30°C下响应相似，仅略有变化（根据刺激和温度，活性范围为50%至125%），但PSMα启动子在不同刺激下表现出显著的温度依赖性变化。在37°C下，PSMα启动子被EDTA（一种广谱金属螯合剂，包括钙、锰、铁、铅、锌和铜）强烈刺激。然而，在30°C下，EDTA会抑制PSMα启动子活性。这表明温度在不同刺激下调节PSMα表达中的关键作用。众所周知，营养免疫期间过渡金属的有限可用性是细菌激活与入侵相关的基因的信号。然而，我们在这里证明，PSMα启动子在37°C下被EDTA特别刺激。当使用特异性螯合剂如2,2′-bipyridine（2,2′-BP）针对铁或TPEN针对锌时，PSMα启动子被抑制。这表明PSMα表达可能在多种过渡金属同时缺乏或另一种金属离子（如钙、镁或铜，EDTA也会影响这些离子）缺失时被刺激。由于Teg41启动子活性似乎相对恒定，观察到的活性变化可能归因于对细胞内过程的全局生理影响，这些影响可能在细胞水平上影响转录和翻译，或者归因于PSMα启动子的TSC。这些发现促使我们推测，在共生状态（如皮肤，30°C），金黄色葡萄球菌不会因金属螯合而上调PSMα表达。然而，当金黄色葡萄球菌转变为病原状态并侵入深层组织时，温度升高与多种过渡金属的有限可用性结合可能触发PSMα表达。这一假设与我们实验室之前的数据一致，显示金黄色葡萄球菌中PSMα的产生与温度有关，较高温度导致PSMα产生增加。

我们利用流式细胞术分析了PSMα和Teg41启动子活性的单细胞水平。我们的研究揭示了PSMα和Teg41的表达在群体中并非均匀，尤其在3小时和24小时的生长阶段表现出变异。值得注意的是，在6小时时，对应于TSB和RPMI中的晚期指数生长阶段，细胞表现出PSMα和Teg41启动子活性的均匀分布。这一发现具有重要意义，因为它表明变异主要发生在指数生长阶段之外。在指数生长阶段，细胞处于活跃的复制状态，群体感应机制激活agr系统和RNAIII，从而调控大约15%的金黄色葡萄球菌基因。一个被广泛接受的假设是，在指数生长阶段，细胞群体应表现出均匀的表达，而当细胞离开指数生长阶段时，它们会变得不同步。有趣的是，我们的数据在3小时时（对数期）反驳了这一假设，观察到PSMα和Teg41的表达存在异质性，尤其是在TSB中，表现出高Teg41和PSMα启动子活性的细胞亚群。这一独特的亚群在24小时时仅重新出现在Teg41中。

Conlon等人（36）的研究表明，在稳定期，由于细胞内ATP水平降低，持久细胞（一种处于休眠状态的小亚群，对抗生素具有耐受性）会形成。此外，TCA循环的失活也可能触发持久细胞的形成，这与ATP水平无关。在稳定期，当营养变得稀缺，细胞进入饥饿状态时，应激反应被激活；TCA循环活性降低；细胞内ATP水平下降。我们观察到的稳定期细胞亚群可能包含持久细胞。有趣的是，向RPMI培养基中添加铁或锌在3小时时增加了PSMα和Teg41的表达比例。

然而，这些过渡金属如何影响亚群动力学仍然不清楚，因为它们的影响在后期时间点未被观察到。值得注意的是，在RPMI中添加20 μM的ZnSO4后，细胞表现出与TSB中相似的行为，3小时时的群体比例相似。可能，向RPMI中添加过渡金属支持了细胞内金属酶的必要金属的正确结合，从而增强了其功能。这反过来可能有助于我们在实验中观察到的特殊亚群。然而，需要进一步的研究来完全理解和表征这些群体。

综上所述，我们的研究揭示了Teg41表达在各种条件下的相对稳定性，而PSMα表达对环境刺激高度敏感，尤其是在37°C和存在EDTA的情况下。这表明了一种调控机制，使金黄色葡萄球菌从共生状态转变为病原状态。在单细胞水平上观察到的启动子活性变异，特别是在过渡金属的影响下，突显了这些调控元件的动态特性，并表明需要进一步研究以全面理解这些机制。