利用磁性生物打印的肉芽肿模型来模拟牛对牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis）的免疫反应

《mSphere》：Modeling immune responses of cattle to Mycobacterium bovis using magnetic bioprinted granulomas

结核分枝杆菌对人类和牲畜健康构成威胁，牛结核杆菌作为人畜共患病，而人类结核杆菌在牛体内通常不引发明显感染。本研究开发了一个三维体外结核 granuloma 模型（IVGLS），通过磁细胞标签和牛白细胞成功模拟了结核 granuloma 的不同阶段（先天和成熟）。BCG 在 IVGLS 中复制并触发巨噬细胞转化为泡沫细胞，IVGLS 释放大量 Th1 相关细胞因子和化学趋化因子，并表现出糖酵解偏向的代谢特征。该模型为研究免疫反应提供了新平台，有助于牛结核疫苗开发和新干预措施设计。

　　结核病（TB）仍然是人类和牲畜健康的一大威胁。引起TB的结核分枝杆菌属（MTC）成员与宿主共同进化了数千年，至今仍对全球公共卫生造成重大影响。虽然MTC成员在基因层面上具有99.9%的相似性，但它们在宿主偏好性上存在显著差异。例如，Mycobacterium tuberculosis（Mtb）是一种适应人类宿主的病原体，其感染可以导致严重的疾病，而Mycobacterium bovis则主要引起牛结核病，是一种已知的动物源性结核病。尽管常规的诊断方法无法区分Mtb和M. bovis，但M. bovis对人类的传播风险在许多结核病流行地区被低估。尽管近年来的根除计划减少了牛结核病的发病率，但在许多国家，牛结核病仍然是地方性流行病，导致了巨大的经济损失。因此，深入了解牛结核病的免疫反应对于公共卫生和畜牧业具有重要意义。

TB的病理特征是形成组织化的多细胞病变结构，称为肉芽肿。结核分枝杆菌通过气源性感染被肺泡巨噬细胞吞噬，并可能迁移到肺间质中。在感染过程中，单核细胞和巨噬细胞被招募，形成肉芽肿的核心区域。一旦树突状细胞、中性粒细胞和淋巴细胞进入肉芽肿，它们会发展成包含多种细胞类型的有序结构。在这样的微环境中，巨噬细胞会转变为多核巨细胞、上皮样巨噬细胞和泡沫样巨噬细胞，这些细胞在TB肉芽肿中占据主导地位。TB的预后与病变的严重程度密切相关，病变可以从固态逐渐发展为坏死性的“干酪样”结构，再到成功清除的“无菌性”肉芽肿。

动物模型在研究结核分枝杆菌引起的免疫反应方面做出了重要贡献，但它们通常无法完全反映TB的组织病理学特征。小鼠不是Mtb或M. bovis的自然宿主，且缺乏与人类相似的病理表现。而非人类灵长类动物和牲畜物种则能够表现出自然宿主的病理特征，但实验成本和伦理问题限制了其广泛应用。从自然宿主中获取肉芽肿样本较为困难，且仅能提供疾病的某个时间点的快照。值得注意的是，不同自然宿主在对抗结核分枝杆菌的防御机制上存在差异。例如，人类巨噬细胞几乎不产生一氧化氮（NO），而牛巨噬细胞则会释放NO，并且牛结核病肉芽肿在矿化前表现出丰富的诱导型NO反应。近年来，研究者们致力于开发球体模型以模拟肉芽肿的三维结构。虽然肉芽肿纤维化和干酪样变性仍难以再现，但这些模型有助于研究不同免疫细胞群体及其对肉芽肿结构的影响。

我们报告了一种由牛白细胞组成的新型肉芽肿模型。这种模型被称为体外肉芽肿样结构（IVGLS），通过使用纳米颗粒技术生成，不需要物理基质。IVGLS被设计为反映TB肉芽肿的不同阶段：由巨噬细胞组成的先天阶段IVGLS，以及包含淋巴细胞的成熟阶段IVGLS。除了显示细胞转化和糖酵解活性外，IVGLS还揭示了巨噬细胞的特定空间死亡模式，并释放了与Th1相关的细胞因子和趋化因子。稳定的IVGLS能够重现肉芽肿特有的特征，这些特征在传统的单层细胞培养中并不存在，为高通量肉芽肿研究提供了一个实用的框架。

为了生成IVGLS，我们首先从健康、干扰素γ释放试验（IGRA）阴性的荷斯坦牛中分离出单核细胞，并通过培养将其转化为巨噬细胞。培养过程在室温下进行，如果未特别说明则在室温下进行。血液被稀释后，通过Biocoll分层离心分离出外周血单核细胞（PBMC）。随后，通过离心去除血小板，并对细胞进行洗涤。巨噬细胞在培养基中培养7天，使其分化为巨噬细胞，期间每4天更换培养基。未贴壁的细胞被收集并冷冻保存。在生成IVGLS时，使用了超低附着板，以减少细胞的亲水性。分化后的巨噬细胞被分离并接种到含有培养基的孔板中，进行过夜培养。为了评估细胞活力，巨噬细胞被分离、染色并使用BD Fortessa进行检测。

为了研究BCG在IVGLS中的感染情况，我们使用了带有mCherry或GFP标记的BCG丹麦株。BCG在Middlebrook 7H9培养基中培养，加入甘油、吐温80和Middlebrook白蛋白葡萄糖催化酶增强物。培养条件为37°C、避光、摇晃培养，使用对数生长期的菌液（OD600=0.3-0.8）。BCG悬液在低温下离心，去除杂质，并调整至合适的感染倍数（MOI=0.1）。感染后的巨噬细胞在38°C、5% CO2下培养4小时，随后离心以减少细胞损失，再用cRPMI培养基洗涤。

为了生成纳米颗粒（NPs），我们分别合成了铁氧化物纳米颗粒（IO-NPs）和金纳米颗粒（Au-NPs）。IO-NPs的合成过程包括铁(III)氯化物和氨水的混合，形成铁(III)氢氧化物，随后加入铁(II)氯化物并进行磁性分离。Au-NPs的合成则涉及四氯金酸和柠檬酸钠的混合，并加热至95°C。NPs的形成通过紫外-可见吸收光谱和Zetasizer Ultra进行表征。为了确保NPs的组成和特性在不同批次之间一致，我们调整了颗粒数比例。所有NPs在使用前均通过LB琼脂进行无菌检查。

IVGLS的生成过程包括将未感染的bMDM和感染的bMDM组合成不同的结构。为了区分BCG的影响，我们分别构建了包含未感染bMDM的IVGLS和包含感染bMDM的IVGLS。在生成IVGLS时，我们使用了磁性生物打印技术，通过磁性悬浮和生物打印形成稳定的球体结构。此外，我们还通过添加自体PBMC来构建成熟的IVGLS，这些PBMC在2 dpi时被加入。通过高内容显微镜技术，我们评估了IVGLS中的细胞数量，并确认了成熟IVGLS中细胞数量的增加。

通过使用荧光标记的BCG，我们观察到BCG在IVGLS中的复制情况。结果表明，IVGLS比单层培养提供了更好的BCG复制环境。此外，我们还检测了IVGLS中的细胞死亡模式，发现成熟的IVGLS中细胞死亡率显著高于未感染的IVGLS。通过流式细胞术和高内容显微镜技术，我们分析了IVGLS中不同细胞类型（如CD3+ T细胞和CD79a+ B细胞）的分布情况，并确认了它们在IVGLS中的动态变化。这些结果表明，IVGLS能够模拟肉芽肿中的细胞死亡过程，且细胞死亡模式与体内情况相似。

IVGLS中的巨噬细胞表现出泡沫样细胞的特征，这是TB肉芽肿的一个显著标志。我们通过BODIPY染色评估了IVGLS中中性脂质的含量，并发现成熟的IVGLS中中性脂质的积累显著增加。这可能与IVGLS中的细胞代谢变化有关，特别是糖酵解的增强。此外，我们还通过高内容显微镜和流式细胞术评估了IVGLS的代谢特征，发现IVGLS中的巨噬细胞表现出显著的糖酵解倾向，这与体内TB肉芽肿的代谢特征一致。

IVGLS还释放了丰富的趋化因子和细胞因子，如CCL2、CCL4和IL-8。这些因子在体内TB肉芽肿的形成和进展中起着重要作用。我们通过磁珠基的多重细胞因子检测和ELISA检测了这些因子的浓度，并发现IVGLS中某些因子的水平显著高于单层培养。这表明IVGLS能够更真实地模拟体内TB肉芽肿的免疫反应环境。

IVGLS的代谢特征主要朝向糖酵解方向发展，这与体内TB肉芽肿的代谢变化一致。我们通过检测乳酸和一氧化氮的水平评估了糖酵解和氧化磷酸化的活动。结果表明，IVGLS中的乳酸水平在一周内显著增加，且一氧化氮的释放也比单层培养更明显。这些发现支持了IVGLS在模拟体内TB肉芽肿代谢特征方面的有效性。

尽管IVGLS在模拟体内TB肉芽肿方面取得了进展，但该模型仍存在一些局限性。例如，IVGLS未能完全反映体内观察到的多样化免疫细胞浸润，且缺乏组织驻留细胞如肺泡巨噬细胞和成纤维细胞。此外，IVGLS的培养时间限制在7天内，无法完全模拟晚期肉芽肿的形成过程。未来的研究可以考虑延长培养时间，以观察更长时间的细胞转化和肉芽肿动态变化。同时，通过功能化的纳米颗粒，可以进一步研究体内肉芽肿中细胞因子的梯度分布。

总之，我们开发了一种基于牛白细胞的三维肉芽肿模型，能够模拟TB肉芽肿的不同阶段，并重现体内肉芽肿的特征。这种模型不仅有助于研究牛结核病的免疫反应，还可能为人类TB的疫苗和干预措施提供新的思路。IVGLS为TB肉芽肿的研究提供了一个灵活且稳定的平台，能够揭示免疫细胞在多细胞微环境中的动态行为，为深入理解TB的免疫机制提供了新的工具。