铜绿假单胞菌的效应蛋白TesG通过NLRC5调控巨噬细胞的替代性活化途径

《mSphere》：The Pseudomonas aeruginosa effector protein TesG regulates alternative activation of macrophages through NLRC5

铜绿假单胞菌分泌蛋白TESG通过调控NLRC5信号通路诱导巨噬细胞M2型极化，抑制炎症反应并促进慢性肺感染免疫逃逸。体内外实验证实TESG/NLRC5轴在慢性感染免疫调控中的关键作用。

　　Pseudomonas aeruginosa 是一种常见的临床致病菌，因其广泛的基因组和强大的遗传可塑性，能够在多种环境中生存，对患者健康构成重大威胁。这种细菌的致病能力与其表达的大量毒力因子密切相关，这些因子不仅能够突破宿主的免疫防御机制，还能在与其他微生物的竞争中占据有利的生态位。P. aeruginosa 在感染过程中展现出高度的适应性，能够在特定部位（如肺部）将急性感染转化为慢性感染。慢性感染的一个显著特点是宿主感染部位的免疫微环境被异常调控，导致宿主免疫系统和干预治疗在清除病原体方面效果有限。在慢性感染阶段，P. aeruginosa 会经历一系列表型变化，以适应肺部环境，包括毒力因子、运动性、铁获取能力以及抗生素耐受性等。因此，深入研究 P. aeruginosa 的致病机制对于开发新的抗菌治疗策略具有重要意义。

我们之前的研究发现了一种关键的效应蛋白 TesG，它通过 I 型分泌系统被分泌，并在 P. aeruginosa 的慢性感染过程中发挥重要作用。值得注意的是，TesG 的表达模式与急性感染阶段的毒力因子有所不同，其表达在慢性感染期间显著上调。TesG 通过抑制 RhoGEF-Rho GTPase 信号通路，干扰中性粒细胞的募集、巨噬细胞的功能以及细胞因子的产生，从而帮助 P. aeruginosa 逃避宿主免疫系统的杀伤。这一发现表明，TesG 在免疫调节中的作用可能与其它毒力因子有所不同，并在慢性感染中发挥不可替代的作用。此外，一项基于我们初步数据的临床研究也表明，TesG 的表达可能成为慢性 P. aeruginosa 肺部感染的潜在生物标志物，这进一步强调了对 TesG 在慢性感染中作用机制的深入研究的重要性。

在我们之前的工作中，我们利用单细胞测序技术揭示了急性与慢性肺部感染模型中免疫细胞的图谱。研究发现，尽管慢性感染状态下免疫细胞的比例和数量并未发生显著变化，但细胞间的相互作用显著增强，表明巨噬细胞等免疫细胞处于异常激活状态。巨噬细胞作为固有免疫系统的重要组成部分，不仅在维持机体稳态中发挥关键作用，还在对抗病原体方面具有重要作用。巨噬细胞的表型和功能受到微环境的调控，表现出高度的可塑性。在不同的外部刺激下，巨噬细胞通常分为经典激活的 M1 型和替代激活的 M2 型。M1 型巨噬细胞主要负责产生促炎性细胞因子，激活免疫系统以清除病原体，而 M2 型巨噬细胞则参与组织修复、重塑、血管生成和维持组织稳定。我们之前的研究表明，TesG 可能通过调节巨噬细胞的存活率和细胞因子分泌，影响 P. aeruginosa 在宿主中的免疫逃逸。然而，TesG 如何调控巨噬细胞功能的具体机制仍有待进一步阐明。

NOD 样受体（NLR）家族是固有免疫感知途径中的主要组成部分，NLRC5 是 NLR 家族的一个成员，主要在免疫细胞中表达，并广泛参与多种病理过程，如肾纤维化和糖尿病等。然而，NLRC5 在免疫中的具体作用仍不清楚。一些研究表明，NLRC5 的过表达可以增强 IFN-α 的表达，而其内源性表达的抑制则会导致 Sendai 病毒介导的 I 型干扰素表达的减少。NLRC5 还可以作为关键的 NLR 感受器，响应 PAMP/DAMP 和 DAMP/细胞因子的组合，驱动固有免疫细胞的死亡。尽管如此，关于 NLRC5 在细菌免疫调节中的作用机制的研究仍较为有限。

本研究中，我们发现 TesG 处理能够诱导巨噬细胞向 M2 型极化。通过一系列体内和体外实验，我们进一步探索了其作用机制。结果显示，TesG 通过促进 NLRC5 的表达，从而诱导巨噬细胞向 M2 型极化。这一过程主要通过 NLRC5 已知的调控机制实现。值得注意的是，TesG 并未直接与 NLRC5 相互作用，这表明其作用可能依赖于其他未知的调控因子。此外，我们还发现，TesG 通过 NLRC5 所涉及的已知调控通路（如 caspase-1、NF-κB 和 JAK 通路）影响巨噬细胞的极化。使用特定的通路抑制剂进行实验，我们发现这些抑制剂能够部分削弱 TesG 引起的 M2 型巨噬细胞极化，支持我们的假设，即 TesG/NLRC5 信号通路通过调控这些通路来诱导 M2 型极化。

我们还建立了 NLRC5 基因敲除小鼠模型，进一步验证了 NLRC5 在 TesG 诱导巨噬细胞极化中的作用。在 NLRC5 敲除小鼠中，TesG 无法诱导 M2 型巨噬细胞极化，这表明 NLRC5 是 TesG 诱导巨噬细胞极化的关键因子。通过慢性肺部感染小鼠模型，我们发现 TesG 通过 NLRC5 信号通路显著影响巨噬细胞的极化，从而帮助 P. aeruginosa 逃避宿主免疫系统的监视。这一发现不仅揭示了 P. aeruginosa 在慢性感染中如何调控宿主免疫微环境，还为开发针对慢性肺部感染的诊断和治疗策略提供了新的思路。

在本研究中，我们还发现 TesG 与 NLRC5 的相互作用可能并不直接，而是通过其他辅助蛋白实现。尽管 NLRC5 与 TesG 之间未发现直接相互作用，但这种可能性仍然存在。此外，我们还探讨了 NLRC5 在调控 NF-κB 信号通路中的作用，发现 NLRC5 通过与 IKKα 和 IKKβ 相互作用，阻止它们的磷酸化，从而抑制 NF-κB 信号通路。同样，NLRC5 还能通过阻止 MAV 与 RIG-I 的结合，抑制 IFN 信号通路，从而阻止 IRF3 的磷酸化。因此，TesG/NLRC5 信号通路可能通过调控这些已知的 NLRC5 通路来诱导巨噬细胞的 M2 型极化。

本研究不仅揭示了 TesG 在 P. aeruginosa 慢性感染中的作用机制，还为理解病原体如何通过复杂的免疫调节策略实现慢性感染提供了新的视角。我们发现，TesG 通过 NLRC5 促进巨噬细胞向 M2 型极化，从而抑制炎症反应，有助于细菌的长期存活。这一发现表明，TesG 可能是 P. aeruginosa 免疫逃逸的关键因子。然而，本研究也存在一些局限性。例如，虽然 NLRC5 与 NLRP3 可以形成炎性小体，但 TesG 对这一过程的影响仍不清楚。此外，NLRC5 的亚细胞定位对其功能至关重要，但我们的实验结果表明，TesG 并不影响 NLRC5 的亚细胞分布。因此，TesG 与 NLRC5 之间的具体作用机制仍有待进一步研究。

本研究通过一系列体外和体内实验，揭示了 TesG 通过 NLRC5 信号通路诱导巨噬细胞向 M2 型极化的机制。这一发现不仅加深了我们对 P. aeruginosa 免疫逃逸策略的理解，还为开发针对慢性肺部感染的新型治疗手段提供了理论依据。我们还发现，TesG 与 RhoA 等小 GTP 酶的相互作用可能并不直接，而是存在一定的功能冗余。此外，TesG 对 NLRC5 的调控可能依赖于其他尚未明确的因子。这些发现为未来的研究提供了新的方向，并有助于进一步揭示 P. aeruginosa 在慢性感染中的致病机制。

本研究还涉及了多种实验方法和技术，包括单细胞测序、流式细胞术、定量 PCR、Western blot 和共免疫沉淀等。这些技术的综合应用使得我们能够全面地分析 TesG 对巨噬细胞极化的影响，并进一步揭示其作用机制。例如，通过流式细胞术，我们能够定量分析巨噬细胞的极化状态，而定量 PCR 和 Western blot 则帮助我们评估 NLRC5 的表达水平。共免疫沉淀实验则用于检测 TesG 与 NLRC5 之间的相互作用，结果表明两者之间不存在直接的相互作用。

本研究的成果不仅为 P. aeruginosa 的慢性感染机制提供了新的见解，还为临床治疗提供了潜在的靶点。TesG 作为一种关键的效应蛋白，其表达水平可能成为慢性 P. aeruginosa 肺部感染的生物标志物。此外，NLRC5 作为 TesG 诱导巨噬细胞极化的重要因子，可能成为未来治疗慢性感染的潜在靶标。通过深入研究 TesG/NLRC5 信号通路，我们希望能够找到新的方法来干预 P. aeruginosa 的免疫逃逸机制，从而提高慢性感染的治疗效果。

本研究的发现表明，P. aeruginosa 通过调控宿主免疫微环境，能够实现对宿主免疫系统的逃避，从而维持其在宿主体内的长期存活。TesG 作为这一过程中的关键因子，其作用机制可能涉及多种复杂的信号通路和调控因子。未来的研究可以进一步探讨这些机制，以期找到更有效的治疗方法。此外，我们还发现，尽管 TesG 与 NLRC5 之间没有直接相互作用，但其作用可能依赖于其他尚未明确的辅助因子。这些发现不仅有助于理解 P. aeruginosa 的致病机制，也为开发针对慢性感染的新型治疗策略提供了新的思路。