从孟加拉国达卡分离出的铜绿假单胞菌噬菌体PaFZ4的完整基因组序列

《Microbiology Resource Announcements》：Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa bacteriophage PaFZ4 isolated from Dhaka, Bangladesh

本研究完成从孟加拉国医院污水分离的噬菌体PaFZ4的基因组测序，揭示其线性双链DNA结构（43,335 bp），含65个编码序列，属Phikmvvirus（Autographiviridae科）。通过Illumina MiSeq测序及SPAdes/Pilon组装，验证基因组完整性（CheckV），并与相似性高的vB_PaeP_PZH3噬菌体进行基因组比对，确认其裂解生活史。

　　

摘要

本文报告了噬菌体PaFZ4的完整基因组序列，该噬菌体能够感染铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）菌株。PaFZ4是从孟加拉国达卡的医院废水中分离得到的，初步鉴定属于Phikmvvirus属（Autographiviridae科）。PaFZ4的基因组为线性结构，长度为43,335个碱基对（bp），包含65个编码序列。

声明

Pseudomonas aeruginosa是一种革兰氏阴性杆菌，长度约为1–5微米，宽度为0.5–1.0微米。耐药性的P. aeruginosa会导致严重的公共卫生问题，并被世界卫生组织列为ESKAPE病原体之一。本研究的主要目的是对从医院污水中分离出的噬菌体PaFZ4进行基因组分析。

2023年5月31日，从孟加拉国达卡的Kurmitola综合医院收集了250毫升的污水样本。这些样本首先通过0.45微米的Whatman滤纸和0.22微米的注射器滤膜过滤，以去除大颗粒物和细菌。随后在4°C下以12,000转/分钟（rpm）的速度离心15分钟。过滤后的样本再次通过0.22微米滤膜过滤，并转移到新的Eppendorf管中。

通过系列稀释并在西替米德琼脂（Himedia，印度）上培养，从达卡Bashundhara R/A周边收集的多种污水样本中分离出P. aeruginosa菌株。从西替米德琼脂平板上分离出纯化的P. aeruginosa菌落。随后，将处理过的污水样本与200微升的P. aeruginosa菌液（OD₆₀₀值为0.5）以不同比例（1:1和1:2）混合，并采用双层琼脂法接种在LB培养基上。培养平板在37°C下孵育24小时以观察噬菌斑的形成。通过三轮单噬菌斑分离纯化单个噬菌斑。使用DNeasy Blood & Tissue Kit（QIAGEN，美国）从纯化的噬菌斑裂解物中提取DNA。

使用Illumina DNA Prep（Illumina，美国加州圣地亚哥）制备DNA文库，并在Illumina MiSeq平台上进行测序，共获得698,258对末端序列（每条序列250 bp），平均读长为250 bp。原始读序列在Galaxy Europe平台上进行处理：使用FastQC v0.11.2进行质量控制（6），使用Trimmomatic v0.39进行接头修剪（7），使用SPAdes v4.2.0进行De novo组装（8），并使用Pilon v1.20进行 polishing（9）。使用BBMap v35.85计算覆盖深度（10），使用Quast v5.3检查组装质量（11），并使用CheckV v1.0.3确认基因组完整性（100%（12）。组装后的基因组长度为43,335 bp，GC含量为62.31%（表1；图1）。使用Bandage（13）确认基因组为线性双链DNA结构。使用PhageTerm（14）分析基因组末端，结果表明其采用头部包装（pac-type）机制。

表1

表1 噬菌体PaFZ4的分离来源、测序详情及基因组特征

属性	PaFZ4
分离地点	孟加拉国达卡
分离来源	医院废水
基因组长度（bp）	43,335
GC%	62.31
编码序列数（CDS）	65
覆盖度	645.16
科	Autographiviridae
属	Phikmvvirus
NCBI登录号	PV610699

图1

图1 （A）分离出的PaFZ4噬菌体与P. aeruginosa噬菌体vB_PaeP_PZH3（登录号：PQ562891）的序列比对。两个基因组之间的间隙代表缺失区域。灰色部分表示PaFZ4的序列，绿色部分表示参考基因组vB_PaeP_PZH3的序列。蓝色箭头标出了编码序列（CDS）。黄色峰值表示正GC偏斜，紫色峰值表示负GC偏斜，红色峰值表示GC含量。（B）使用Mauve软件对PaFZ4和vB_PaeP_PZH3的基因组进行全序列比对。局部共线块（LCBs）表示保守区域；相同颜色的块表示匹配区域。高水平的序列一致性反映了这两种噬菌体之间的进化保守性。

使用PHANOTATE 1.5.0（15）在BV-BRC（https://www.bv-brc.org/）中进行注释，识别出65个编码序列，其中21个具有潜在功能，44个为假想蛋白。使用Proksee（16）和Mauve（17）生成PaFZ4与P. aeruginosa噬菌体vB_PaeP_PZH3（登录号：PQ562891）的基因组比对图（图1）。由于BLASTn相似度最高（96.94%的同一性和94%的覆盖度），选择vB_PaeP_PZH3作为参考基因组。使用PhageAI Life Cycle Classifier v1.6.0（18）预测PaFZ4的生活型为毒性（裂解型）。使用PhaBOX（19）确定PaFZ4的分类群。除非另有说明，所有程序均使用默认参数。

致谢

作者感谢North South University提供的财务支持（授权号NSU: CTRG-22-SHLS-20，授予SRS）。作者衷心感谢NSU生物化学与微生物学系的Kowshik Pal先生在噬菌体分离和特性鉴定方面的协助，以及NSU生物化学与微生物学系的Afia Anjum女士在分析过程中提供的巨大帮助和持续支持。