从患病肉鸡种鸡中分离出的Enterococcus faecium PM1的完整基因组序列

《Microbiology Resource Announcements》：Complete genome sequence of Enterococcus faecium PM1 isolated from a diseased broiler breeder

本研究测定了马来西亚柔佛州某养鸡场中分离的致病性肠球菌 Enterococcus faecium PM1的全基因组，包含2,520,275 bp的环状染色体和四个质粒（138,051；15,903；5,174；3,191 bp）。通过Illumina NovaSeq短读（150 bp）和Oxford Nanopore长读测序技术，结合Unicycler组装，获得总碱基8,176,427,123 bp的高质量基因组，完整度达98.57%。该菌株分离自反复抗生素治疗无效的禽类病例，基因组分析揭示了耐药性和致病性相关基因的潜在机制。

　　

摘要

我们报告了从一家商业农场患病肉鸡种鸡的砂囊中分离出的Enterococcus faecium PM1的完整基因组。该基因组包含一个2,520,275 bp的环状染色体以及四个大小分别为138,051 bp、15,903 bp、5,174 bp和3,191 bp的质粒。

公告

Enterococcus faecium属于ESKAPE病原体群（包括Staphylococcus aureus、Klebsiella pneumoniae、Acinetobacter baumannii、Pseudomonas aeruginosa和Enterobacter属菌），它既可用作益生菌，也在工业和畜牧业中逐渐被视为一种致病菌（1–3）。本文报道了从马来西亚雪兰莪州一家商业农场患病肉鸡种鸡的砂囊中分离出的E. faecium PM1的完整基因组。尽管进行了多次抗生素治疗，该农场仍面临疾病反复爆发的情况。

在疾病爆发期间自然死亡的肉鸡种鸡的砂囊被无菌地匀浆处理于10 mL的无菌磷酸盐缓冲盐水中（4）。将匀浆液接种到胰蛋白胨大豆肉汤（TSB；Oxoid，英国）中，并在37°C下静置培养24小时。将过夜培养物进行系列稀释后接种到5%血琼脂平板（Oxoid，英国）上。通过重新划线培养纯化菌落，从中选出了PM1菌株。将单个菌落接种到含有0.6%酵母提取物的10 mL TSB中（Oxoid，英国），并在37°C下静置培养16小时。随后将细菌细胞沉淀并用于DNA提取，以进行短读长测序。

细菌沉淀物被送往外部实验室（Axil Scientific Pte Ltd., 新加坡）进行短读长测序。简要来说，使用Quick-DNA Fungal/Bacterial Miniprep Kit（Zymo Research，美国）提取基因组DNA（gDNA），并使用NanoDrop分光光度计（Thermo Fisher Scientific，美国）进行定量。根据VAHTS Universal Pro DNA Library Prep Kit for Illumina（Vazyme，中国）协议制备双端DNA文库，然后在Illumina NovaSeq 6000平台上进行150 bp双端测序。使用FastQC（v0.11.9）对原始Illumina短读长数据进行质量评估（5），并使用trim galore（v0.6.10）移除Phred分数低于20的读长（6）。

对于长读长测序，使用QIAamp DNA Micro Kit（QIAGEN，美国）提取gDNA，无需剪切或大小筛选，并使用Quant-iT dsDNA Assay Kits（Thermo Fisher Scientific，美国）进行定量。使用Ligation Sequencing Kit V10（SQK-LSK110，Oxford Nanopore Technologies，英国）构建文库。测序在MinION Mk1C设备上进行，流式细胞为R9.4.1（FLO-MIN106D，Oxford Nanopore Technologies，英国），持续时间为24小时。使用Dorado（v0.4.1）进行碱基调用（7），并移除Phred分数低于8的读长。使用nanostat（v1.6.0）评估读长质量（8），并使用Filtlong（v0.2.1）过滤低质量读长（9》），移除了长度小于1 kbp、大于500 Mbp的读长以及最不理想的10%的碱基。

我们使用Unicycler（v0.4.8）对短读长和长读长进行了混合de novo组装（10），并使用Kraken2（v2.1.3）和Standard-8数据库（2023年10月9日更新；benlangmead.github.io/aws-indexes/k2）确认了PM1菌株的细菌身份为E. faecium（11）。最终基因组使用NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline（v6.10）进行注释（12）（表1）。质粒通过PlasmidFinder（v2.1）（13）和PLSDB（使用，v2023_11_03_v2搜索）（14）进行鉴定。除非另有说明，否则使用默认参数。组装的基因组包含一个完整的环状染色体和四个质粒。

表1

表1Enterococcus faecium PM1的基因组特征

特征	菌株PM1
Illumina测序	读长数量	11,377,416
读长（bp）	150
Oxford Nanopore测序	读长数量	3,005,421
平均读长（bp）	2,720
总碱基对数	8,176,427,123
N50（bp）	3,706
最终组装及GenBank登录号	染色体	2,520,275 bp (CP196035.1)
质粒
pPM1_01 (repUS15a)	138,051 bp (CP196036.1)
pPM1_02 (rep2a)	15,903 bp (CP196037.1)
pPM1_03 （未知a)	5,174 bp (CP196038.1)
pPM1_04 (rep11ca)	3,191 bp (CP196039.1)
短读长覆盖度	636×
长读长覆盖度	186×
GC含量（%）	38.1
完整性（%）	98.57
注释详情	基因（总数）	2,655
CDSs（总数）	2,572
rRNAs	18
tRNAs	61
ncRNAs	4

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