胃腺癌及近端胃息肉（GAPPS）患者中癌症发生的基因组与转录组特征

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：Genomic and transcriptomic landscape of carcinogenesis in patients with gastric adenocarcinoma and proximal polyposis of the stomach (GAPPS)

GAPPS（胃腺癌和近端多发性息肉综合征）的基因组进化过程显示，APC体细胞突变存在于息肉和腺癌，而KRAS突变仅见于腺癌，且两者常共同发生。RNA测序表明KRAS信号通路在GAPPS中特异性增强，而TP53突变缺失，与散发性胃癌不同。研究为早期诊断和手术时机提供了分子依据。

　　### 胃癌及其遗传性特征

胃癌（Gastric Cancer, GC）是全球范围内癌症死亡的第三大原因，同时也是第五常见的恶性肿瘤（1）。尽管环境因素如幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）、烟草和高盐饮食在胃癌的发展中起着重要作用，但有估计表明，多达5%至10%的胃癌病例是由遗传易感性引起的，这种遗传易感性通常由生殖细胞中的致病性变异所导致（2）。在这些遗传性胃癌中，胃腺癌和近端胃多发性息肉综合征（Gastric Adenocarcinoma and Proximal Polyposis of the Stomach, GAPPS）是一种常染色体显性遗传综合征，其特征是胃体和胃底区域出现息肉，且有较高的腺癌倾向（3）。GAPPS患者一生中患胃癌的风险估计在13%至25%之间（4）。这种疾病最初于2012年被描述，诊断标准包括：a) 胃体和胃底的息肉，但没有结肠或十二指肠息肉；b) 在索引病例中，胃近端息肉数量超过100个，或在已诊断为GAPPS的患者的第一度亲属中，息肉数量超过30个；c) 多为胃底腺息肉（Fundic Gland Polyps, FGP），部分伴有异型增生或家族成员患有异型增生的胃底腺息肉或胃腺癌；d) 常染色体显性遗传。此外，必须排除其他导致胃底腺息肉的原因，如质子泵抑制剂（Proton Pump Inhibitors, PPIs）或其他可遗传的胃息肉综合征（5）。

在2016年，Li等人报告称，APC基因启动子1B区域的点突变是GAPPS的致病性变异（6）。这些突变包括c.-195A>C、c.-125delA、c.-191 T>C和c.-192A>C，这些突变位于Ying Yang 1（YY1）结合位点内，通过中断YY1的结合来降低启动子1B的表达。另一项研究也指出，在患有GAPPS的患者中，胃底腺息肉（FGPs）中会发生APC的第二突变，可能是由于野生型等位基因的丢失或获得蛋白质截断变异（6）。这项研究使得通过基因检测诊断GAPPS成为可能。尽管GAPPS的意识正在逐渐提高，全球相关报告也在增加（7–9），但关于GAPPS中从正常黏膜发展到息肉再到癌变过程中积累的遗传突变仍不清楚。在结肠中，人们普遍接受腺瘤-癌序列（adenoma-carcinoma sequence）的概念，即通过一系列选定的遗传突变，从正常上皮逐渐发展为异型增生上皮，最终成为癌变（10）。然而，在胃中，这一概念尚未被明确界定，除了某些类型的息肉（如增生性息肉或腺瘤）外，通常不推荐进行息肉切除（11）。

### 本研究的总体目标

本研究旨在揭示从正常黏膜到息肉再到癌变的进化过程。为此，我们对每位患者的胃癌、息肉和正常黏膜样本进行了多点采样，并进行了全外显子组测序（Whole-Exome Sequencing, WES）和RNA测序（RNA sequencing）。通过全面的突变和转录组分析，我们希望深入了解GAPPS的生物学特性。我们总共收集了54个样本，包括12个正常幽门部黏膜样本、15个正常胃体/胃底黏膜样本、13个息肉样本和14个癌变样本。从这些样本中提取DNA和RNA，并提交至WES和RNA-seq分析。对于WES，我们还提交了外周血DNA作为对照。对于RNA-seq，有一份样本未通过质量检查。我们还全面调查了基因组改变（包括拷贝数变异和体细胞突变）、克隆结构以及转录组动态变化。

### 研究结果

#### 患者特征

七名GAPPS患者的临床和病理特征总结于表1。患者的年龄从24岁到57岁不等，其中三人是女性，四人是男性。所有患者均为非吸烟者，并且在初次诊断时通过抗体检测显示对幽门螺杆菌感染呈阴性，且没有使用PPIs的历史。对于每个家族的首发病例，诊断是由于母亲因胃癌、上腹部疼痛以及健康检查而进行的内镜检查。

表1展示了患者的临床和病理特征，包括患者编号、家族、性别、年龄、幽门螺杆菌感染状态、吸烟情况、检测时间、UICC分期、手术方式、胃切除时间以及病理结果。例如，患者P1和P2在初次诊断后进行定期内镜监测，一年后通过活检发现癌变并接受手术切除。患者P2和P4在诊断时通过内镜检查发现癌变，因此直接接受了手术。患者P6和P7虽然在诊断时未发现癌变，但基于患者的意愿进行了预防性全胃切除。总体而言，这七名患者中有五人被诊断为胃癌，其中四人接受了根治性全胃切除，而患者P5由于存在多处肝转移，未接受胃切除，而是接受了系统性化疗。所有病例的癌变病理分类均为管状腺癌。每个家族的系谱图显示在补充材料中的SI Appendix, Fig. S3。切除的组织样本和病例的内镜图像也展示在SI Appendix, Fig. S2中。

#### 病理评估

为了评估从正常黏膜到息肉再到癌变的病理变化，我们对每例中从癌变、息肉和正常黏膜（胃体/胃底和幽门部）多个部位收集的样本进行了宏观采样，并进行了苏木精-伊红（Hematoxylin and Eosin, HE）染色。所有样本均由经验丰富的病理学家根据HE染色结果进行了组织学回顾（见图1B）。在癌变样本中，主要成分为分化良好的管状腺癌。在息肉样本中，主要诊断为胃底腺息肉（FGP）伴有增生。此外，还观察到一些与GAPPS相关的特征性发现，即高增殖性异常凹陷（Hyperproliferative Aberrant Pits, HPAP），并且其中一份样本显示出低级别异型增生（详情见SI Appendix, Note 1）。

此外，家族2的病理发现与其他家族有所不同。家族2的癌变主要表现为异型增生（癌症的早期阶段），并且在癌变组织和正常组织中均观察到强烈的淋巴细胞浸润（见SI Appendix, Fig. S3）。为了研究正常黏膜向FGP和癌变的进展原因，我们对所有样本进行了WES和RNA-seq分析。

#### GAPPS的基因组特征

为了研究GAPPS的基因组变化，我们分析了WES数据。首先，我们确认了外周血中检测到的APC启动子1B的生殖细胞变异（chr5: 112707527 T>C: c.-191T>C）存在于所有样本中。WES的平均覆盖度为175（范围为144至236，见SI Appendix, Table S1）。我们按照GATK最佳实践使用Mutect2进行突变调用。在54个样本中，总共发现了2,927个体细胞突变。每种组织的突变负担（Mutational Burden, MB）顺序为：正常幽门部黏膜 < 正常胃体/胃底黏膜 < 息肉 < 癌变（见SI Appendix, Fig. S4A）。此外，当比较每个家族时，家族3的癌变显示出较高的MB，这被认为与癌症阶段有关。然而，家族2的癌变MB低于其他家族，某些样本的MB水平与正常黏膜和息肉相似（DNA_029、DNA_030）（见图2A）。为了研究癌症驱动基因的突变情况，我们聚焦于COSMIC 736个癌症驱动基因（包括The Cancer Gene Census中的Tier 1和Tier 2基因，见图2A）。APC的体细胞突变是最常见的突变，占78.6%的癌变样本和53.8%的息肉样本（见图2B）。APC的体细胞突变并未在正常胃体/胃底和幽门部黏膜样本中被检测到。除了APC和KRAS外，各病理组之间未发现共享的遗传变异，除了ZRSR2。在散发性胃癌中，TP53突变是最常见的，但我们在GAPPS的息肉和癌变样本中未发现TP53突变。在晚期癌变样本（P5）中，还观察到了SMAD4、MSH2、PHOX2B、MED12、TGFBR2和KEAP1的突变。使用PolyPhen-2评估这些突变对蛋白质结构或功能的影响，结果显示MSH2和PHOX2B的突变为良性，而SMAD4、TGFBR2、MED12和KEAP1的突变为致病性（见SI Appendix, Table S3）。此外，我们还调查了最近一项关于日本胃癌的大规模研究中报告的显著共变异基因是否在我们的GAPPS样本中出现。然而，我们并未观察到该研究中报告的共变异基因。

#### APC基因的失活机制

在先前的研究中，已经确定GAPPS的致病性变异是APC启动子1B区域的生殖细胞变异（6）。该变异位于启动子区域，可能影响基因表达水平。为了确认APC表达的减少，我们比较了携带和不携带启动子变异的等位基因的表达情况。由于我们无法从RNA-seq中获得APC启动子1B的读数，我们使用APC外显子中的生殖细胞杂合变异来研究每个病理组织中的等位基因表达偏倚（见图3A）（详见“材料与方法”部分）。所有组织中均观察到等位基因不平衡，表明启动子1B变异导致APC表达的显著减少。等位基因不平衡在癌变和息肉组织中尤为显著。对于这一现象的可能原因，我们考虑了以下两种可能性：a) 携带启动子变异的等位基因表达进一步减少；b) 不携带启动子变异的等位基因表达进一步增加。为了检验这两种可能性，我们研究了APC表达与等位基因不平衡之间的关系。然而，没有观察到明显的表达差异和等位基因不平衡之间的相关性（见SI Appendix, Fig. S7），因此无法验证上述两种可能性。

接下来，我们关注APC的体细胞突变。我们研究了这些突变如何影响APC的功能。图3B和图3C展示了APC的突变分布。所有检测到的突变均位于第1600个密码子上游，尤其是第1450至1600个密码子区域，其中大多数为无义突变。这一结果与FAP相关FGP的研究结果一致（18, 19），这些研究显示，FAP患者的FGP中，体细胞突变主要发生在第1450至1556个密码子区域，并且所有检测到的突变均为无义突变。由于GAPPS中的APC突变被认为与FAP中的APC突变具有相似的功能，因此在这一区域的突变可能在GAPPS中作为息肉的致病性变异。

APC突变已知会导致经典Wnt通路的功能障碍，进而导致β-连环蛋白（β-catenin）的稳定和核转移，这是结肠癌发展的重要机制（20）。因此，我们进行了免疫组织化学染色以确定β-连环蛋白是否在GAPPS中也出现这种情况，但未观察到β-连环蛋白在核中的积累（见SI Appendix, Fig. S8）。这些结果表明，尽管APC突变是功能失活的，但它似乎并未促进WNT/β-连环蛋白通路的激活。

#### APC与KRAS突变的共同发生

由于KRAS在APC之后具有第二高的突变频率，并且仅在癌变中被突变，我们接下来专注于这一基因。无论病例或家族如何，涉及的氨基酸变化均包括两种已知的热点突变，G12V和G12D，并且几乎所有癌变样本均含有这些KRAS突变（见图4A）。基于上述结果，我们研究了APC和KRAS突变在多个癌变样本中的共同发生情况。我们对P1进行了系统分析，因为该患者提供了五份癌变样本（见SI Appendix, Fig. S3）。这些癌变样本是从不同的解剖区域宏量采样的，但无法确定它们是否来源于同一克隆或不同克隆。因此，我们比较了每份样本中的遗传突变。所有样本中都存在的突变定义为“共享突变”，部分样本中存在的突变定义为“分支突变”，而仅在个别样本中发现的突变定义为“私有突变”。基于这些突变模式，我们估计了每份样本的克隆起源。仅有一个突变被确认为共享突变，但该突变也被检测到在同一名患者的息肉和正常黏膜样本中，因此被认为是错误地被归类为生殖细胞突变（见SI Appendix, Table S6）。基于这些发现，可以推测这些癌变样本并非单一克隆，而是三个子克隆，每个子克隆都反复获得了APC和KRAS突变（见图4D）。对其他病例进行了类似分析，但未获得相似结果，因为这些肿瘤样本要么是单一克隆，要么未检测到KRAS突变（见SI Appendix, Fig. S9）。在未检测到KRAS突变的癌变样本（DNA_020、DNA_029、DNA_030）中，未发现APC突变，这可能是因为样本纯度极低，导致突变检测不足。这表明APC和KRAS突变的共同发生对于GAPPS相关的癌变几乎是必需的。

#### 组织间及与散发性胃癌的表达比较

我们发现APC突变在从正常黏膜到息肉的转变中起着重要作用，而KRAS突变则在息肉癌变过程中起作用。为了明确在从正常黏膜到息肉再到癌变的过程中哪些通路和基因被上调，我们使用RNA-seq数据进行了通路分析。首先，为了研究病理发现与RNA表达之间的关系，我们对所有样本进行了主成分分析（PCA）（见图5A）。与病理评估结果一致，PCA也显示家族2与其他家族不同；在家族1和3的癌变和其他样本中，样本被分为不同的簇，而在家族2的所有样本中，样本被归为同一簇。此外，当分别检查每种病理组织时，除了正常幽门部黏膜外，家族2的样本与其他家族的样本被分为不同的簇。由于病理评估显示家族2的正常黏膜、息肉和癌变组织中存在淋巴细胞浸润，我们估计这些样本的免疫细胞比例，并使用CIBERSORT进行分析（见图5A）。与病理发现一致，家族2的癌变、息肉和正常胃体/胃底组织中存在大量免疫细胞，主要是T细胞。

为了确保样本的纯度，我们通过提取与病理发现和统计聚类相匹配的样本进行了进一步分析（见图5A）。我们还通过比较每种病理组织的表达情况，确定了哪些通路被上调。在与正常幽门部黏膜相比时，正常胃体/胃底黏膜中与三羧酸循环（TCA cycle）、代谢和线粒体相关的通路被增强，这与之前使用健康胃黏膜的研究结果一致（22）。这可能反映了胃体/胃底细胞分泌酸所需的能量主要由线粒体中的三羧酸循环提供（23）。事实上，估计胃体/胃底的壁细胞中约有30%至40%的细胞质被线粒体占据（24）。除了这些通路外，我们还观察到与细胞周期相关的通路，如E2F靶点和G2-M检查点在息肉中被富集。这可能反映了息肉形成过程中细胞增殖的特征。与息肉相比，癌变中除了癌症相关通路如上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition）和止血外，KRAS信号通路也被富集，这与突变分析结果一致。基因本体（Gene Ontology, GO）分析也显示了相似的结果（见SI Appendix, Fig. S11）。

为了明确GAPPS与散发性胃癌之间的差异，我们对GAPPS和散发性胃癌（TCGA-STAD）的癌变和正常黏膜样本进行了基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA）。结果显示，与各自的正常黏膜相比，GAPPS和散发性胃癌中均显著富集了E2F靶点、G2-M检查点和有丝分裂纺锤体相关的通路。然而，KRAS信号通路仅在GAPPS中被显著富集（见图5C和图5D）。这些结果表明，即使在同类型的胃癌中，GAPPS的癌变也可能通过特定的通路进行，这与散发性胃癌不同。

#### APC与KRAS突变的协同作用

已有研究指出，APC和KRAS突变的共同发生可能在癌症进展中起协同作用。例如，Janssen等人报告称，KRAS引起的Wnt/β-连环蛋白信号通路增强可能促进肿瘤的可塑性和自我更新能力，从而显著增加肿瘤数量和恶性行为（27）。此外，Phelps等人指出，β-连环蛋白的核积累需要KRAS的活性（28）。然而，这些研究主要集中在结肠癌，而对胃癌中APC和KRAS突变的协同作用研究较少。因此，进一步研究APC和KRAS突变在GAPPS癌变中的相互作用是必要的。

另一方面，KRAS突变是否独立于APC突变发生，或者是否依赖于APC突变，目前尚不清楚。在本研究中，大多数息肉携带APC突变，而大多数癌变则额外表现出KRAS突变，这表明这些突变可能按顺序发生。在结肠癌的研究中，已提出APC突变激活Wnt通路，为KRAS突变的获得和肿瘤进展创造有利环境（29）。然而，也不能排除突变随机发生，仅在肿瘤进展过程中按顺序出现的可能性。有观点认为，APC和KRAS突变在肿瘤进展过程中可能是随机发生的（30）。因此，未来需要通过谱系追踪等分析来明确KRAS突变是否能够独立驱动肿瘤发生，或者是否依赖于先前的APC突变。

#### β-连环蛋白的核积累

APC突变已知会导致β-连环蛋白的核积累，这是结肠癌发展的重要机制（31）。因此，我们进行了免疫组织化学染色以确定β-连环蛋白是否在GAPPS中也出现这种情况，但未观察到β-连环蛋白在核中的积累（见SI Appendix, Fig. S8）。这些结果表明，尽管APC突变是功能失活的，但它似乎并未促进WNT/β-连环蛋白通路的激活。此外，一些研究指出，GAPPS的某些FGP中会发生APC的第二突变，可能是由于野生型等位基因的丢失或获得蛋白质截断变异（6）。然而，关于β-连环蛋白核积累的报告存在不一致，有些研究支持这一现象，而有些则不支持（25, 32）。APC具有多个β-连环蛋白结合位点，包括15个和20个氨基酸重复序列（15R和20R）（33）以及SAMP重复序列（34）。此外，有研究指出，由突变导致的截断APC仍可能调节β-连环蛋白的转录活性（35）。这些发现表明，β-连环蛋白的下游效应可能因截断APC中结合位点的功能而有所不同。此外，一项研究探讨了FAP患者中FGP形成机制，虽然未在FAP患者的生物样本库中检测到APC突变，但在FGP活检样本和类器官中观察到了增强的Wnt信号（36）。这表明，即使在没有所谓的“第二打击”（即APC突变）的情况下，FGP的形成也可能受到Wnt信号的影响。此外，最近的研究发现了与Wnt无关的促生长基因，如Bclaf3和Prka，这表明FGP可能通过Wnt无关的通路进行增殖（37）。综上所述，这些观察结果突显了β-连环蛋白在FGP形成过程中的复杂调控机制，表明APC依赖和Wnt无关的机制都可能参与FGP的发病机制。

#### TP53突变的缺失

在散发性胃癌中，TP53突变是最常见的基因突变之一，但在GAPPS的癌变样本中未检测到TP53突变。这一发现可以将GAPPS与其他类型的胃癌区分开来。然而，散发性胃癌中也存在一些亚型，如胃底腺型胃癌（Gastric Adenocarcinoma of the Fundic Gland Type, GA-FG），这些亚型也未表现出TP53突变（38, 39）。因此，TP53突变可能不是胃癌发生过程中的必要事件，这一现象突显了胃癌发生通路的分子异质性。此外，在晚期癌变样本中观察到了SMAD4和TGFBR2的致病性突变，这表明突变的积累与腺瘤-癌序列的概念一致。Jung等人对散发性胃癌的腺瘤和癌变样本进行了配对采样分析，报告称腺瘤和癌变可能从早期腺瘤并行进化，而不是通过腺瘤逐步发展为癌变（40）。这些结果表明，GAPPS中的突变积累过程与其他类型的胃癌不同。由于本研究样本数量有限，未来需要更大样本量的研究来解决这一问题。

#### 家族间的异质性

以往关于GAPPS的研究表明，不同家族之间以及同一家族中携带相同致病性APC变异的个体之间存在异质性。例如，在一项涉及24名患者来自8个家族的研究中，有些个体在20多岁时就出现了胃息肉，而有些个体即使到了65岁仍未出现息肉（7）。在我们的研究中，家族2的正常黏膜、息肉和癌变组织中观察到了特定的淋巴细胞浸润，这可能反映了家族间的异质性。此外，我们还调查了临床背景和微卫星不稳定性（Microsatellite Instability, MSI）状态，以探讨家族间异质性的潜在原因。然而，我们未能在该家族与其他家族之间找到明显的差异。因此，需要进一步增加病例数量以明确这一异质性。

#### 研究的局限性

本研究存在一些局限性。首先，研究仅在单一机构进行，样本数量相对有限。考虑到地区和种族差异，需要在多个机构进行验证以获得更广泛的数据支持。其次，样本的纯度相对较低。由于没有使用激光显微切割等技术来提高纯度，因此无法获得足够的RNA和DNA用于测序。尽管在提交测序前进行了病理确认，但样本中各组织成分的比例并未进行验证。此外，样本大小的数据未提供，因此无法讨论息肉大小与突变数量之间的关系。需要使用更高纯度的样本以解决本研究中未澄清的问题。第三，我们无法确定淋巴细胞浸润是否是家族特异性的，还是由其他因素引起的。我们检查了可能的原因，如幽门螺杆菌感染和MSI状态，但未获得能解释家族间差异的结果。虽然肿瘤异质性可能是导致观察到的家族差异的原因，但未来需要通过增加病例数量进行进一步研究。

#### 总结

本研究揭示了GAPPS癌变过程中的驱动事件景观。我们发现，在GAPPS中，APC的体细胞突变发生在癌变和息肉中，而KRAS的突变则仅发生在癌变中。此外，我们还发现APC和KRAS突变在癌变中反复共同发生，无论是跨病例还是同一病例中的子克隆。KRAS突变可能作为GAPPS癌变的生物标志物，这可能有助于早期诊断和确定适当的手术时机。这些发现加深了我们对GAPPS发病机制的理解，并为未来的临床应用提供了重要的信息。