β-葡萄糖苷酶共价中间体的中子晶体学研究揭示了其催化中心的重构过程

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：Neutron crystallography of the covalent intermediate of β-glucosidase reveals remodeling of the catalytic center

本研究通过X射线与中子晶体结构分析，揭示了GH家族1中β-葡萄糖苷酶Td2F2的催化机制，发现Tyr295与Glu352形成氢键，调控水分子在共价中间体形成与水解中的作用，并验证了该残基在催化双位移反应中的关键功能

　　

重要性

糖苷水解酶（GHs）在生物体内执行多种功能，目前已知有超过180个酶家族。尽管氢键和质子转移在酶促反应中起着重要作用，但在大分子X射线晶体学中氢原子通常是不可见的。对于那些能够保留异构体的糖苷水解酶，人们提出了通过酸碱催化以及共价糖基-酶中间体的形成和水解来催化反应的机制。在这里，我们报道了一种β-葡萄糖苷酶的中子晶体结构，其中氢原子和氘原子被高分辨率地可视化。在共价中间体形成过程中，观察到了复杂的氢键网络以及催化中心的显著重构，揭示了一种由催化中心中的酪氨酸残基加速的详细催化机制。该酶属于糖苷水解酶家族1，代表了众多采用保留异构体机制的酶。

摘要

能够保留异构体的糖苷水解酶（GHs）通常通过共价中间体来催化双置换反应。然而，针对与糖苷配体结合状态的糖苷水解酶的中子晶体学研究尚未开展。在这项研究中，我们以GH家族1中的β-葡萄糖苷酶Td2F2作为模型酶进行了研究。我们利用室温下的氢/氘交换晶体，确定了Td2F2在无配体状态、与2-脱氧-2-氟葡萄糖苷（2F-Glc）抑制剂结合形成共价中间体以及与葡萄糖产物复合物时的联合X射线/中子结构，其中子衍射分辨率达到了1.80–1.70 ?。我们识别出了大量与2F-Glc的羟基形成氢键的氢键，并确定了氘原子的位置。酸碱催化残基Glu166通过由Asn293介导的氢键网络得以固定。在无配体和葡萄糖复合物状态下，Tyr295与催化亲核残基Glu352形成氢键；同时，活性中心经历了显著的重构，包括Glu352和Tyr295侧链的位移以及水分子的参与。在室温下的2F-Glc结构中观察到了Tyr295的另一种构象，这表明它在脱糖步骤中可能参与了亲核水分子的定位。对Y295F突变体的稳态和亚稳态动力学分析进一步支持了Tyr295在糖基化和脱糖步骤中的功能作用。许多其他能够保留异构体的糖苷水解酶家族中也存在与亲核基团形成氢键的酪氨酸残基，这突显了其在催化过程中的重要性。基于从中子结构中确定的氘/氢原子位置，我们提出了Td2F2的详细反应机制。