核糖体蛋白L5 I60V突变通过增强翻译活性调控T细胞急性淋巴细胞白血病药物敏感性

《Biochemical Pharmacology》：Ribosomal protein L5 (RPL5/uL18) I60V mutation is associated to increased translation and modulates drug sensitivity in T-cell acute lymphoblastic leukemia cells

本研究针对T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）中约10%患儿存在的核糖体蛋白（RP）体细胞突变问题，聚焦RPL5-I60V突变，利用CRISPR-Cas9构建基因敲入模型，揭示了该突变通过促进大亚基（60S）生成、增强核糖体翻译内在活性，并导致细胞对MNK1抑制剂、甲福明（metformin）、高三尖杉酯碱（homoharringtonine, HHT）等多种靶向翻译过程的化合物敏感性增加的分子机制，为基于“癌核糖体（oncoribosome）”的个性化治疗策略提供了新见解。

　　

在儿童血液肿瘤中，T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）是一种侵袭性强、预后较差的恶性肿瘤。尽管当前化疗方案可使超过90%的患儿获得长期缓解，但复发仍是临床面临的严峻挑战，其根源在于白血病细胞产生耐药性。近年来，科学家们发现，除了常见的NOTCH1等基因突变外，编码核糖体蛋白（Ribosomal Proteins, RPs）的基因在约10%的儿科T-ALL患者中也存在体细胞突变，这为理解白血病发生机制开辟了新视角。核糖体是细胞内负责蛋白质合成的精密机器，其功能异常可能通过改变特定mRNA的翻译效率，从而驱动肿瘤发生。这些携带突变的核糖体被称为“癌核糖体（oncoribosomes）”。然而，特定的RP突变如何影响核糖体功能，进而调控白血病细胞的生物学行为及其对治疗药物的反应，仍是亟待阐明的科学问题。

为了深入探究RP突变在T-ALL中的作用，研究人员将目光投向了核糖体蛋白L5（RPL5）。RPL5是核糖体大亚基（60S）核心突起（central protuberance）的关键组成部分，不仅参与核糖体组装，还与非经典的应激反应、DNA修复等过程相关。在T-ALL患者中已发现RPL5的不同位点突变，其中I60V替换便是一例。为了模拟这一遗传改变，研究团队选择在源自儿科T-ALL患者的Jurkat细胞系中，利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，成功构建了纯合型RPL5-I60V点突变敲入细胞模型，并通过Sanger测序和液滴数字PCR（ddPCR）进行了基因型验证。为了确保实验结果的可靠性，后续所有功能实验均平行使用了两个野生型（WT）和两个I60V突变型克隆。

研究人员首先系统评估了I60V突变对核糖体本身的影响。通过蔗糖密度梯度离心进行多聚核糖体图谱（polysome profiling）分析，发现与野生型相比，I60V突变细胞的60S和80S核糖体亚基峰面积有所减少，提示大亚基的生物合成可能受到了轻微影响。这一观察得到了生物分析仪（Bioanalyzer）检测结果的支持，突变细胞胞质总RNA中28S/18S rRNA的比值显著降低。那么，掺入了突变RPL5的核糖体在组成上是否还有其他异常呢？研究团队采用高盐条件纯化了核糖体，并进行了基于质谱（MS）的定量蛋白质组学分析。结果非常特异：在核糖体组分中，唯一发生显著丰度差异的蛋白就是RPL5本身——野生型细胞中富集野生型RPL5，而突变细胞中富集I60V突变型RPL5，其他核糖体蛋白的含量则无显著变化。此外，对核糖体RNA（rRNA）上两种最丰富的化学修饰——2′-O-甲基化（2′-O-methylation）和假尿苷化（pseudouridylation）——进行的深度测序分析（RiboMethSeq和HydraPsiSeq）也表明，I60V突变并未引起rRNA修饰谱的全局性改变。

尽管核糖体组成上的变化看似单一，但其功能后果却十分显著。细胞内的蛋白质合成速率检测（SUnSET assay，基于嘌呤霉素（puromycin）掺入新生肽链）显示，RPL5-I60V突变细胞的翻译活性明显高于野生型细胞。更令人信服的是，从细胞中分离纯化的核糖体，在无细胞翻译体系（cell-free translation assay）中，无论是依赖于5′帽子结构（cap-dependent）还是内部核糖体进入位点（IRES）的翻译起始，突变型核糖体合成报告蛋白（萤火虫荧光素酶，Fluc/海肾荧光素酶，Rluc）的固有活性都比野生型核糖体高出约50%。这种增强的翻译能力也转化为了细胞表型上的优势：在细胞增殖实验中，RPL5-I60V突变细胞，尤其是在培养后期达到较高密度时，表现出比野生型细胞更快的生长速率。这表明，单个氨基酸的替换竟能赋予白血病细胞生长优势。

基于突变核糖体具有更高翻译活性的发现，研究团队提出了一个关键科学问题：携带RPL5-I60V突变的细胞，对靶向蛋白质合成通路不同环节的化合物，其敏感性是否会发生变化？为此，他们筛选了一系列作用机制各异的药物进行测试，包括：MNK1抑制剂（影响eIF4E磷酸化）、甲福明（metformin，影响mTOR通路）、司维斯特罗（silvestrol，抑制eIF4A）、高三尖杉酯碱（homoharringtonine, HHT）、茴香霉素（anisomycin）、白藜芦醇（resveratrol）和潮霉素B（hygromycin B）等直接或间接影响翻译的化合物，以及常用于T-ALL治疗的化疗药物阿糖胞苷（cytarabine）。

3.2.1. 突变对药物介导的代谢活性调节的影响

通过阿尔玛蓝（AlamarBlue） assay检测细胞代谢活性，研究发现，在48小时处理后，与野生型细胞相比，RPL5-I60V突变细胞对大多数测试化合物（MNK1抑制剂、甲福明、司维斯特罗、茴香霉素、阿糖胞苷、高三尖杉酯碱、白藜芦醇）表现出相同或更高的敏感性。然而，一个明显的例外是潮霉素B，突变细胞对其显示出抵抗性。这一结果提示，RPL5突变并不导致普遍的耐药或增敏，其效应与药物的具体作用机制密切相关。

3.2.2. 突变对药物介导的蛋白质合成调节的影响

为了直接观察药物对翻译过程的抑制效果，研究人员在药物处理24小时后进行了SUnSET assay。结果显示，茴香霉素和高三尖杉酯碱能有效抑制野生型和突变型细胞的蛋白质合成，且对突变细胞的抑制效果更强。潮霉素B则未抑制蛋白合成，反而在两种细胞中均引起蛋白表达增加，突变细胞的抵抗性更为突出。MNK1抑制剂和司维斯特罗能降低蛋白合成，但其效果与RPL5基因型无关。甲福明和白藜芦醇在野生型细胞中效果不明显，但却能显著抑制突变细胞的蛋白合成。阿糖胞苷对两者的蛋白合成均无显著影响。这些数据表明，具有高翻译活性的RPL5-I60V细胞可能更依赖于持续的蛋白质合成过程，从而对某些翻译抑制剂更为敏感。

3.2.3. 突变对药物介导的细胞毒性调节的影响

进一步的细胞活力（RealTime-Glo? assay）、细胞膜通透性（死细胞蛋白酶活性）和凋亡（Caspase-Glo? 3/7活性）检测描绘了更完整的细胞命运图景。长达72小时的活力监测表明，多数药物在处理40小时后开始显现基因型依赖性的效果，I60V突变细胞通常更敏感。在细胞死亡机制方面，MNK1抑制剂主要诱导凋亡，且基因型间无差异；甲福明引起突变细胞显著的膜通透性增加；司维斯特罗对野生型细胞影响甚微，但能诱导突变细胞发生凋亡和膜通透性增加；高三尖杉酯碱处理下，突变细胞膜通透性更高；茴香霉素对两种细胞均有强效，且对突变细胞作用更强；白藜芦醇和阿糖胞苷则导致突变细胞更显著的膜通透性增加和凋亡激活。再次印证了之前的发现，潮霉素B是唯一一个突变细胞表现出更强抵抗性的药物。

综上所述，本研究首次报道了T-ALL相关的RPL5-I60V突变能够被成功整合进功能性核糖体中，并赋予其更高的内在翻译活性，进而促进白血病细胞增殖。更重要的是，这种“功能获得性”的癌核糖体并非导致广泛的化疗耐药，反而使细胞对多种靶向翻译 machinery 的化合物（潮霉素B除外）更为敏感。这种敏感性的变化与药物诱导的细胞死亡通路（凋亡和/或膜通透性增加）的激活程度相关。该研究不仅深化了我们对核糖体异质性在癌症中功能意义的理解，更重要的是，它揭示了靶向特定癌核糖体或其带来的翻译亢进状态，可能成为治疗携带RP突变的T-ALL患者的一种有前景的精准医疗策略。尽管本研究存在仅使用单一细胞系的局限性，且未能完全排除RPL5非核糖体功能的影响，但其发现为开发针对“癌核糖体”的特异性疗法提供了坚实的实验依据和新的思路。相关研究成果发表在《Biochemical Pharmacology》上。