综述：基于发光追踪技术的进展：应用与未来展望

《Bioconjugate Chemistry》：Advances in luminescence-based tracing technologies: applications and future perspectives

本综述系统比较了生物发光（如萤火虫荧光素酶FLuc）与荧光（如绿色荧光蛋白GFP）技术的优劣，重点介绍了无需外源底物的真菌生物发光途径（FBP）这一革命性自持系统。文章指出，通过人工智能（AI）驱动蛋白质设计优化FBP的热稳定性和光谱特性，是实现在复杂生物体中无创、实时监测的关键下一步，为未来追踪技术提供了范式转换工具。

　　

引言

生物追踪领域正在经历一场变革性的演变，其标志是挑战传统成像范式的自持发光系统的出现。尽管早期方法主要使用同位素标记，但这些方法在安全性、操作复杂性和时间分辨率方面存在固有局限，这加速了发光技术的采用，其为活体系统中的实时、无创监测提供了增强能力。

在发光方法中，生物发光和荧光成像已成为必不可少的工具。然而，这两种技术都受到对外部试剂的依赖的限制：荧光素酶需要底物递送，而荧光蛋白（FPs）依赖外部光照，这可能引入光毒性、自发荧光和深层组织穿透的限制。

目前正在发生一项突破性的转变，即真菌生物发光途径（FBP）的开发。作为一个自持的代谢途径，FBP能够在体内实现连续发光，无需外源底物或光激发。这种内在的自主性代表了与传统报告基因范式的根本背离。然而，野生型FBP的转化潜力受到热稳定性、强度和光谱范围不足的阻碍。因此，通过将FBP与人工智能（AI）驱动的蛋白质优化和从头设计这一强大新工具包相结合，来批判性地综合解决这些挑战至关重要。

本综述及时地提供了发光成像演变系统的分析，绘制了其通过三种基础技术（荧光素酶、FPs和FBP）的发展历程，并提出了其与AI和合成生物学融合的路线图。

荧光素酶生物发光技术的进展与应用

荧光素酶是一类特殊的氧化还原酶，能催化荧光素底物的氧化反应，产生光发射。萤火虫荧光素酶（FLuc）是分子成像中不可或缺的工具，具有高量子产率（～0.41）和适合深层组织成像的红移发射光。

海洋环境拥有最多样化的生物发光生物，许多物种使用腔肠素作为共同底物。其中，海肾荧光素酶（RLuc）、高斯荧光素酶（GLuc）和芒光荧光素酶（MLuc）已成为非常有价值的报告蛋白。

定量性能指标对于报告基因的选择至关重要。FLuc是灵敏度的基准，而海洋荧光素酶通常发射蓝光（～480 nm），量子产率较低，便于多重检测，但会导致更大的组织衰减。

细菌生物发光代表了一种独特的、由luxCDABE(G)操纵子编码的自持机制。这种自给自足的架构消除了对外源荧光素的需求。然而，该原核系统在真核细胞中的功能性表达仍然是一个主要挑战。

荧光素-荧光素酶系统由于其无与伦比的灵敏度和特异性，已成为生物学研究中不可或缺的工具。这些生物发光报告基因促进了从分子到机体水平的定量分析，主要应用包括基因表达谱分析、生物过程的多重检测以及蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）的实时定量。

荧光素酶互补成像（LCI）是一种用于在体内检测和量化动态PPI的生物发光检测方法。与双分子荧光互补（BiFC）等不可逆方法相比，荧光素酶互补的非共价性质允许实时监测相互作用动力学。

荧光素酶生物传感器通过将特定分析物的识别元件与荧光素酶报告基因的酶活性偶联而起作用。该平台的多样性进一步体现在其适用于监测代谢通量和追踪植物激素动力学。

荧光素酶成像在深层组织环境中的更广泛应用受到信号强度和发射光谱限制的制约。传统荧光素酶固有的低光子产量对低丰度目标的检测构成挑战。此外，它们主要的蓝绿发射对于体内使用并非最佳选择。红移荧光素酶突变体及其工程底物的开发直接解决了传统系统的光谱限制。

底物依赖性提出了另一个主要限制，因为大多数荧光素酶需要外源荧光素给药。这引入了多种复杂情况。为了克服这些障碍，未来的研究应侧重于开发具有更高亮度、红移发射光谱和内源底物生产能力的增强型荧光素酶系统。

基于荧光蛋白的追踪技术

绿色荧光蛋白（GFP）自发现以来，已成为活细胞成像不可或缺的工具。其功能源于一个独特的p-羟基亚苄基-咪唑啉酮发色团，该发色团在保护性β-桶支架内自动催化形成。

从蓝色（BFP）和青色（CFP）到黄色（YFP）和红色（DsRed）变体的多种荧光蛋白（FPs）的工程化，为活细胞成像提供了一个多功能工具包。这些基因编码的报告蛋白通过荧光共振能量转移（FRET）生物传感器的开发变得特别具有变革性，这些传感器将分子相互作用转化为可量化的荧光信号。

该技术已在生物界中实现了突破性的应用。在植物系统中，FPs在追踪转基因表达、评估CRISPR/Cas9编辑效率以及可视化根发育和应激信号的细胞器间转导等基本过程方面发挥了重要作用。同时，在哺乳动物系统中，FPs允许以单细胞分辨率分析器官发生等复杂过程，并已成为疾病建模和药物发现中不可或缺的工具。

然而，FPs在植物系统中的应用面临独特挑战。叶绿素和细胞壁在绿色光谱范围内的高自发荧光会产生显著的背景噪声。此外，植物细胞独特的生理学特性使FP的成熟和数据解读复杂化。

FPs彻底改变了生物分子相互作用的分析，实现了多色FRET、荧光寿命成像和BiFC等复杂技术。作为基因编码的生物传感器，它们允许对大量细胞分析物进行无创、时空精确的监测。

尽管有其效用，FP系统在定量应用方面面临显著限制。关键挑战包括可变的表达水平和不一致的成熟动力学。此外，它们对荧光显微镜的依赖带来了大量的基础设施要求和专业知识。这些实际问题与可能破坏数据可靠性的固有光物理局限性相结合。

最关键的局限性源于FP本身的内在特性。光漂白会随时间推移不可逆地减弱信号；寡聚化倾向可能人为地聚集融合蛋白并干扰天然生物相互作用；环境敏感性会导致荧光猝灭。

FP系统面临固有的生物学局限性，包括引起光毒性和光漂白的高能激发光，从而限制了纵向研究。近红外FPs（NIR FPs）的开发代表了一项重大进步，可最大限度地减少光散射、自发荧光和光损伤。

虽然FPs仍然是不可或缺的，但这些局限性阻碍了它们在可扩展和临床背景下的使用，推动了当前研究旨在设计具有增强生物相容性的FPs，并开发互补的、非荧光标记策略。

FBP的生物化学与途径机制

真菌生物发光系统，特别是称为FBP的咖啡酸代谢途径，代表了一种独特且进化上保守的生物追踪机制，不同于传统的荧光素酶和荧光蛋白技术。该途径在多种真菌谱系中被发现，表现出显著的生化一致性。其在可食用物种中的存在进一步暗示了良好的生物安全性。

完整的FBP在Neonothopanus nambi中得到充分阐明，揭示了一个由四种酶组成的循环，构成了一个自持的代谢途径。该循环始于咖啡酸被Hispidin合酶（HispS）转化为hispidin，随后被H3H羟基化形成实际的荧光素3-hydroxyhispidin。该荧光素被荧光素酶氧化产生绿光发射（λ_max = 520–530 nm）和caffeylpyruvate。该途径由CPH完成，CPH从caffeylpyruvate再生咖啡酸。这个优雅的循环需要多种辅因子才能持续运行。

FBP的一个关键特征是其在外源系统中的代谢自主性。该途径利用咖啡酸，这是一种植物苯丙烷途径的天然代谢物，也通过酪氨酸代谢在酵母和哺乳动物细胞中内源性产生。这种趋同性使得在异源表达FBP酶时能够实现不依赖底物的生物发光。Kotlobay等人成功地在毕赤酵母、人类细胞和非洲爪蟾胚胎中重建了核心FBP酶，实现了无需外源底物的自主发光。该系统在工程化自主发光植物方面取得了显著成功。后续研究侧重于通过改进的能量和辅因子管理来优化FBP的代谢通量。

FBP在追踪技术中的应用

FBP代表了生物报告技术的一项变革性进步，为各种研究应用建立了一个多功能平台。该系统的自主性允许实时观察关键过程，而无需外部底物。这种能力通过其在通过分离荧光素酶互补监测蛋白质-蛋白质相互作用以及探索基因表达和转录调控动力学中的应用得到例证。

FBP系统的模块化架构使其能够适应各种环境监测应用。一项显著的技术进步是最近开发了一种双响应生物传感器，能够无创可视化生物胁迫下水杨酸和茉莉酸信号动力学。FBP的非侵入性进一步支持了对疾病进展的连续监测。此外，实时发光输出能够实现高通量细胞群体追踪和药物筛选，以精确量化细胞对药理学化合物的反应。

最近的酶工程进展已经开始解决这些局限性，从而提高了FBP的催化效率和稳定性。作为一种可持续生物技术，FBP的无毒、自主性质符合对环保解决方案的需求。

FBP技术的实施有效解决了植物高通量筛选（HTS）中长期存在的挑战。虽然基于色素的系统代表了植物研究的一个进步，但它们仍然受到灵敏度限制和背景干扰的制约。相比之下，FBP的底物独立性、与完整植物的兼容性以及与自动化成像平台的无缝集成显著提高了遗传筛选效率。

当与效应子响应调控元件进行工程化时，FBP构成了一个变革性的生物传感平台。与细菌系统相比，其卓越的跨物种兼容性使其非常适合陆地应用。随着其灵敏度和操作稳定性的进一步优化，基于FBP的系统在高灵敏度环境监测、室内空气质量评估和精准综合害虫管理方面具有特殊前景。

FBP的局限性与挑战

尽管FBP作为一个自主报告系统具有相当大的前景，但它面临着一些必须解决的技术挑战才能广泛实施。一个主要限制是其有限的光子输出。虽然基于FBP的系统超过了细菌生物发光的亮度，但其信号强度仍然远低于优化的外源底物系统（如NanoLuc），特别是在需要高信噪比或深层组织穿透的情况下。

此外，四种酶组分的协调表达给宿主细胞带来了显著的代谢负担，可能干扰天然生理学和转基因稳定性。该途径的光产生也与中心代谢内在相关，随着咖啡酸和NAD(P)H细胞库的波动而变化，而不是提供恒定的基线。这种代谢依赖性使其在需要稳定信号的定量分析中的应用复杂化。

当前的研究重点是通过酶工程提高催化效率、重构遗传构建体以减少代谢负荷以及采用合成调控电路来解耦途径活性与内源性代谢噪声，从而减轻这些局限性。

未来展望

生物发光和荧光技术代表了生物学研究中的基石方法，能够实时分析基因表达、蛋白质相互作用和活体系统中的动态过程。蛋白质工程、人工智能（AI）和代谢优化方面的最新进展有望克服在灵敏度、光谱范围和组织穿透方面长期存在的限制，从而扩展这些技术在基础和转化应用中的范围。

对具有卓越强度和可靠性的生物发光报告基因的需求推动了荧光素酶的合理工程化。从Oplophorus gracilirostris开发NanoLuc荧光素酶标志着一个突破，提供了比传统系统（FLuc/RLuc）高～150倍的信号增强，同时保持优异的物理稳定性。

与荧光素酶工程并行，荧光蛋白工具包也经历了类似的革命，通过克服光漂白和低亮度历史约束的新型变体得到了极大丰富。诸如mNeonGreen、具有卓越光稳定性的StayGold以及工程配对mClover3/mRuby3等蛋白质提供了卓越的性能，实现了持久且灵敏的成像。

AI彻底改变了新型成像蛋白质的设计。Baker实验室采用深度学习方法设计了LuxSit，一种完全从头设计的荧光素酶（13.9 kDa），具有特殊的热稳定性和强大的底物特异性。后续优化产生了Neolux系列，这是更紧凑（13.7 kDa）和催化效率高的酶，能够在体内形成功能性FRET对用于多参数成像。

重大努力集中在开发长波长发射器以增强组织穿透。生物发光系统通过荧光素酶修饰和底物衍生化进行了工程化。例如，通过腔肠素C-8修饰开发的红移NanoLuc变体提供了更亮的发射和改善的深层组织性能。在荧光蛋白领域，近红外变体通过天然蛋白质优化和合成化学进行了工程化。

在这些工程化报告基因的基础上，新兴的FBP代表了一种范式转变，然而，实现其潜力需要系统优化。为了实现这一目标，努力集中在多个方面：增强在植物、动物和微生物中的异源表达；优化调控元件和蛋白质稳定性；以及扩展光谱特性。采用了三种主要策略：（i）AI驱动的从头设计具有定制特性的荧光素酶；（ii）核心FBP酶的定向进化以提高催化效率和稳定性；以及（iii）代谢工程以优化底物可用性和途径动力学。

结论

基于发光的追踪现在已成为实时分析生物过程的基本方法。这些工具与植物合成生物学、基因组工程和AI辅助生物设计的整合，正在为基础和转化研究开启前所未有的机遇。蛋白质工程、计算设计和代谢优化的协同融合正在为新一代自主生物发光系统铺平道路。最终，生物追踪的未来在于创建智能、自适应系统，提供卓越的清晰度和精确度。这些自持技术有望超越实验室，在实时环境监测和可持续照明方面实现变革性应用，以应对紧迫的生态和社会挑战。