囊性纤维化患儿早期铜绿假单胞菌感染的动态演化与治疗适应性研究

《The Journal of Infectious Diseases》：Culture and Adaptation of Pseudomonas aeruginosa During Early Infection in Children With Cystic Fibrosis

本研究针对囊性纤维化(CF)患儿早期铜绿假单胞菌(PA)感染的复杂性，通过对EPIC临床试验中572株分离株进行全基因组测序(WGS)，揭示了29.1%的初始菌株谱系持续存在，15.3%患儿存在多谱系感染。研究发现MLST分型与全基因组SNV分型高度一致，且鉴定出23个早期适应性突变基因，包括lasR、mucA等14个已知致病适应性基因。该研究为CF早期感染治疗策略提供了精准的分子流行病学依据。

　　

在囊性纤维化(CF)患儿的临床管理中，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa, PA)的早期感染犹如一把悬在头顶的达摩克利斯之剑。虽然积极抗生素治疗可清除部分感染，但约28%-40%的患儿仍会发展为慢性感染，最终导致肺功能衰竭。传统培养技术无法区分是治疗失败（原有菌株持续）还是新感染事件（不同菌株再定植），这一盲点直接影响了EPIC临床试验对四种抗生素方案疗效的准确评估。

为破解这一难题，研究团队对EPIC临床试验中190名CF患儿的572株PA分离株进行了全基因组测序(WGS)分析。通过构建核心基因组系统发育树，研究者发现虽然不同患儿感染的PA菌株呈现高度多样性，但个体患儿体内存在重复培养的紧密相关菌株簇。

通过全基因组单核苷酸变异(wgSNV)分析，研究者确立了6000个SNVs作为区分同一谱系与不同谱系的阈值。这一精准分型技术揭示了早期感染的复杂图景：12名患儿在入组时即携带多PA谱系，20名患儿在随访期间出现新谱系，总计29名(15.3%)患儿存在多谱系感染。对初始感染谱系的追踪显示，144个(70.9%)谱系未被再次培养（推定清除），59个(29.1%)谱系持续存在。

研究还对比了传统分型技术的准确性。多位点序列分型(MLST)与wgSNV分型结果100%一致，而脉冲场凝胶电泳(PFGE)错误地将17个遗传相关菌株判定为不同谱系。在进化分析中，研究人员发现42名持续感染患儿的菌株出现了非同义SNVs(nsSNVs)，其中23个基因在≥2名患儿中发生突变，包括lasR（15%）、mucA（13%）等14个已知致病适应性基因。这些突变涉及毒力调控、抗生素耐药、生物膜形成等关键通路，表明PA在CF肺部早期适应过程中存在趋同进化。

关键技术方法包括：对EPIC临床试验队列的190名CF患儿572株PA分离株进行Illumina平台全基因组测序；使用核心基因组系统发育分析和wgSNV分型进行菌株谱系追踪；通过MLST和PFGE与WGS结果进行比对评估分型效率；利用VarScan等工具鉴定致病适应性基因突变。

Whole-genome Sequencing Identified Different Patterns of Early PA Infection in EPIC-CT Subjects

通过全基因组测序构建的系统发育树显示，患儿体内存在重复培养的同一谱系菌株。wgSNV分析确立6000个SNVs为谱系分界阈值，发现15.3%患儿存在多谱系感染，其中70.9%初始谱系被清除，29.1%持续存在。

wgSNV Typing Discriminated PA Lineages Repeatedly Cultured From Those not Cultured Again During the EPIC-CT

基于wgSNV的谱系追踪显示，初始感染的203个谱系中，59个(29.1%)在抗生素治疗后仍能被检测到，提示这些谱系可能对抗生素具有耐受性。

EPIC-CT Subjects had Different Patterns of Early Infection

患儿感染模式呈现多样性：59%患儿初始单谱系被清除，26%初始单谱系持续存在，6%患儿初始谱系清除后出现新谱系，3%患儿初始即携带多谱系。

wgSNV Typing Allowed Re-evaluation of the Microbiological Endpoints of the EPIC-CT

采用wgSNV分型重新评估四种抗生素方案疗效，各方案清除率(66%-72%)无统计学差异，但文化导向治疗组新谱系获得趋势(14%)高于周期治疗组(7%)。

Multilocus Sequence Typing was Superior to Pulsed-field Gel Electrophoresis(PFGE) in Distinguishing PA Lineages

MLST与wgSNV分型结果完全一致，而PFGE在5%的分离株中产生错误分类，表明MLST更适合临床常规分型应用。

Mutations Arise in PA During Early Infections in Individuals With CF

在47名持续感染患儿中，42名患儿的菌株出现nsSNVs，23个基因发生重复突变，包括lasR、mucA等已知致病适应性基因，证实早期感染阶段已开始适应性进化。

本研究通过高分辨率基因组学技术揭示了CF患儿早期PA感染的动态复杂性。wgSNV分型不仅证实了多谱系感染的普遍性(15.3%)，还精准量化了抗生素方案对初始谱系的清除效果(70.9%)。值得注意的是，传统PFGE分型存在显著误判风险，而MLST与WGS结果高度一致，为临床监测提供了实用替代方案。

研究首次系统描绘了早期感染阶段的致病适应性进化图谱：29.1%的持续感染菌株在短期内快速积累突变，包括lasR、mucA等关键致病基因。这些发现解释了为何部分患儿尽管接受强化治疗仍发展为慢性感染——菌株的快速适应性进化可能抵消抗生素效应。

从临床实践角度，本研究为CF早期感染管理提供了重要启示：首先，培养阳性结果需结合分子分型区分复发与新感染；其次，监测特定致病适应性基因突变有助于预测慢性化风险；最后，针对快速进化机制的新型治疗策略可能改善预后。尽管研究开展于CFTR调节剂时代之前，其建立的WGS分析框架为评估 modulator 疗法对感染模式的影响奠定了基础。

这项研究不仅解决了EPIC临床试验遗留的微生物学终点争议，更通过多维度基因组证据建立了早期CF肺部感染演化的新范式。随着精准医学时代的到来，整合基因组学监测的个体化感染管理策略，有望为CF患儿带来更精准的干预时机和治疗选择。