新型3H-吡唑并[4,3-f]喹啉支架衍生物HSB401作为高选择性FLT3抑制剂的发现及其在急性髓系白血病治疗中的应用研究

《European Journal of Medicinal Chemistry》：3 H-pyrazolo[4,3- f]quinoline hinge binder, a tunable scaffold for development of novel kinase inhibitors against FLT3-driven leukemia

本研究针对FLT3突变急性髓系白血病(AML)治疗中存在的耐药性(如FLT3-D835Y突变)和骨髓抑制副作用(如c-KIT抑制)等问题，开发了一种基于3H-吡唑并[4,3-f]喹啉新型支架的FLT3抑制剂HSB401。研究通过系统的构效关系(SAR)分析发现，HSB401对FLT3-ITD(IC50=51 nM)和FLT3-D835Y(IC50=5 nM)具有纳摩尔级抑制活性，且对c-KIT抑制活性显著降低(IC50=512 nM)。作用机制研究表明HSB401通过抑制FLT3信号通路(p-FLT3、p-STAT5、p-ERK1/2)诱导细胞周期G1期阻滞和凋亡。在MV4-11异种移植瘤模型中，口服HSB401(30 mg/kg)显著抑制肿瘤生长(TGI=80.5%)，为克服FLT3抑制剂耐药性和减少骨髓毒性提供了新策略。

　　

急性髓系白血病(AML)是一种恶性血液肿瘤，其中FMS样酪氨酸激酶3(FLT3)基因突变是最常见的遗传学异常之一。FLT3内部串联重复(FLT3-ITD)和酪氨酸激酶结构域点突变(如FLT3-D835Y)会导致FLT3信号通路持续激活，与患者预后不良和化疗耐药密切相关。虽然quizartinib和gilteritinib等FLT3抑制剂已应用于临床，但前者对D835Y突变无效，后者仍存在骨髓抑制等副作用，开发能同时克服耐药突变且毒性更低的新型FLT3抑制剂成为当前研究的迫切需求。

在这项发表于《European Journal of Medicinal Chemistry》的研究中，来自普渡大学的研究团队基于其前期发现的3H-吡唑并[4,3-f]喹啉这一新型激酶铰链结合剂，通过合理的药物设计合成了48个衍生物，系统评价了它们对FLT3激酶和白血病细胞的抑制活性，最终发现了先导化合物HSB401，该化合物不仅能有效抑制FLT3野生型和耐药突变型，还表现出良好的激酶选择性和体内抗肿瘤活性。

研究人员主要采用了以下关键技术方法：1）多组分反应化学合成技术构建化合物库；2）基于荧光染料Resazurin的细胞增殖抑制实验(GI₅₀)评估化合物抗肿瘤活性；3）放射性同位素激酶抑制实验测定化合物对FLT3等多种激酶的半抑制浓度(IC₅₀)；4）流式细胞术分析细胞周期分布和凋亡；5）蛋白质免疫印迹(Western blot)检测FLT3信号通路关键蛋白磷酸化水平；6）微尺度热泳(MST)技术测定化合物与FLT3激酶域的亲和力；7）分子对接模拟化合物与FLT3的结合模式；8）MV4-11细胞异种移植小鼠模型(WuXi AppTec提供)评价体内药效。

2.1. 设计策略

基于前期发现的先导化合物HSD1217(化合物1)，研究人员通过分子对接发现其C7位苯甲酰胺取代基可与FLT3活性位点外的Ser618和Arg764形成氢键。这一发现提示该区域(选择性区域3)是进行结构优化的理想位点，为后续通过酰胺侧链修饰提高活性和选择性提供了理论依据。

2.2. 化学合成

研究采用一锅法至三锅法的简洁合成路线，首先通过Doebner或Povarov多组分反应构建3H-吡唑并[4,3-f]喹啉核心骨架，随后将羧酸中间体直接酰胺化或先将腈基水解为羧酸再酰胺化，高效合成了目标化合物1-48。

2.3. 靶向重组FLT3-ITD的构效关系研究

通过系统评估48个化合物的FLT3-ITD抑制活性和对MV4-11(FLT3-ITD阳性)细胞的抗增殖活性，发现将HSD1217的酰胺侧链修饰为2-(二甲氨基)乙基(化合物17，HSH2177)可显著提高活性(FLT3-ITD IC₅₀=86 nM；MV4-11 GI₅₀=25 nM)。进一步研究表明，C环(环己烷或环庚烷)的大小、E环C1位甲基化以及A环氟化等结构修饰均会影响活性和选择性。

2.4. 候选化合物的扩展激酶和细胞抑制数据

选择8个活性最佳的化合物进行深入评价，发现它们对FLT3依赖的细胞系(MV4-11、MOLM-13、EOL-1、Kasumi-1)表现出显著抑制活性，而对非转化BJ细胞毒性较低。特别重要的是，所有候选化合物均能有效抑制FLT3-D835Y和FLT3-ITD-F691L耐药突变，且对c-KIT的抑制活性远低于FLT3，提示其可能具有更低的骨髓抑制风险。

2.5. 候选化合物体外抑制FLT3信号通路

蛋白质免疫印迹实验证实，候选化合物能浓度依赖性地抑制MV4-11细胞中FLT3自身磷酸化(Y589/591)及其下游信号分子STAT5(Y694)和ERK1/2(T202/Y204)的磷酸化，且作用可持续24小时，表明其能有效阻断FLT3信号通路。

2.6. 候选化合物体外诱导凋亡

研究发现候选化合物处理MV4-11细胞24小时后，可激活caspase-7、caspase-9，引起PARP-1切割，并降低抗凋亡蛋白Mcl-1水平，证明其能诱导细胞凋亡。其中，具有环己烷C环的化合物(17、26、25、27)诱导凋亡能力更强。

2.7. HSB401和HSH3127的激酶选择性

通过KINOMEscan?结合实验和放射性激酶抑制实验综合评价化合物26(HSH3127)和27(HSB401)的激酶选择性谱。结果显示HSB401(选择性评分S(35)=0.356)比HSH3127(选择性评分S(35)=0.333)具有更好的选择性，且对FLT3-D835Y突变体抑制活性最高(残留活性2%)。

2.8. HSB401与FLT3酶的结合

微尺度热泳实验表明HSB401与FLT3激酶域具有纳摩尔级亲和力(K_D值与gilteritinib相当)。分子对接显示HSB401以I型抑制剂方式结合FLT3的DFG-in构象，其3H-吡唑环与铰链区Cys694形成双氢键，氟原子与Gly617形成卤键，酰胺基团与Arg764和Ser618相互作用。

2.9. HSB401在更多FLT3细胞模型中的体外效力

在携带FLT3-ITD-D835Y双重突变的MOLM-13耐药细胞系中，HSB401与gilteritinib同样有效(选择性指数约为1)，而quizartinib和sorafenib活性显著降低(选择性指数分别为621.8和87.2)。此外，HSB401能特异性诱导FLT3依赖的细胞系(MV4-11、MOLM-13)G1期阻滞，而对FLT3非依赖细胞系(THP-1、K562)无此作用。

2.10. HSB401在MV4-11异种移植小鼠模型中的体内效力

在MV4-11细胞异种移植模型中，口服HSB401(30 mg/kg/天，连续29天)可显著抑制肿瘤生长(肿瘤生长抑制率80.5%)，且未引起明显体重减轻等毒性反应，表明其具有良好的体内抗肿瘤活性和耐受性。

3. 讨论与结论

本研究成功将3H-吡唑并[4,3-f]喹啉开发为一类新型FLT3抑制剂支架。通过系统的构效关系研究，发现了先导化合物HSB401，该化合物对FLT3野生型和耐药突变型均具有纳摩尔级抑制活性，且能通过抑制FLT3信号通路诱导细胞周期阻滞和凋亡。与现有FLT3抑制剂相比，HSB401对c-KIT抑制活性显著降低，预示其可能减少骨髓抑制副作用。尤为重要的是，HSB401能有效抑制FLT3-D835Y耐药突变，且在体内模型中表现出良好的口服活性和抗肿瘤效果。这些结果表明HSB401是一个极具开发前景的FLT3抑制剂候选物，为克服FLT3突变急性髓系白血病的治疗挑战提供了新策略。