DNA修复抑制剂与彗星试验联用提升DNA损伤检测灵敏度的研究进展

《Mutagenesis》：The Use of DNA Repair Inhibitors and the Comet Assay– An Overview

本刊推荐：为解决标准彗星试验对DNA损伤检测特异性不足的问题，研究人员系统综述了HU（羟基脲）、Ara-C（阿糖胞苷）和APC（阿非迪霉素）等DNA修复抑制剂在增强彗星试验敏感性方面的应用。通过对40篇文献的荟萃分析发现，70%的研究表明修复抑制剂能显著提升对庞大DNA加合物（如B[a]P诱导损伤）的检测能力，该技术已被纳入AOP（不良结局路径）框架的KE 1879关键事件，为遗传毒性评价提供了新范式。

　　

在遗传毒理学研究领域，如何精准检测DNA损伤一直是科学家们面临的重大挑战。传统的彗星试验（单细胞凝胶电泳）虽能有效检测DNA链断裂（SBs）和碱不稳定性位点（ALS），但这些损伤标志物缺乏特异性——它们既可能直接由基因毒性物质引发，也可能只是DNA修复过程中产生的中间产物。特别是对于庞大DNA加合物（bulky DNA adducts）这类重要损伤，由于它们本身不会直接引起DNA迁移变化，常规彗星试验往往难以捕捉其踪迹。这就如同在犯罪现场只能找到间接证据，却无法锁定真凶一般，严重限制了该技术在环境毒理学、药物安全评价等领域的应用深度。

为突破这一技术瓶颈，西班牙纳瓦拉大学的研究团队在《Mutagenesis》上发表了系统性综述，首次全面评估了DNA修复抑制剂与彗星试验联用技术的价值。研究人员创新性地将羟基脲（HU）、阿糖胞苷（Ara-C）和阿非迪霉素（APC）等抑制剂引入检测体系，通过阻断核苷酸切除修复（NER）途径中的DNA再合成步骤，成功"捕获"了原本转瞬即逝的修复中间体，使得庞大DNA加合物等隐性损伤得以显性化呈现。这项技术不仅被正式纳入"庞大加合物导致突变"不良结局路径（AOP）的关键事件（KE 1879），更为遗传毒性风险评估提供了新的方法论支撑。

研究方法上，团队采用系统文献检索策略，对PubMed数据库中截至2024年12月的相关研究进行筛选。通过严格的纳入排除标准，最终对40篇符合要求的文献进行了数据提取与分析。重点考察了不同DNA修复抑制剂（APC、HU+Ara-C组合、单用Ara-C或HU）在各种实验条件下对DNA损伤检测效果的影响，并特别关注了细胞类型、抑制剂浓度与作用时间等关键变量。

研究结果揭示出四大核心发现：

抑制剂增强效应的普遍性

在70%的研究中，DNA修复抑制剂的加入均显著提高了彗星试验的敏感性。其中7篇文献报道了从"标准试验阴性"到"抑制剂联用阳性"的转变，24篇显示统计学显著差异，6篇虽未进行统计分析但呈现定性增强趋势。这种增强效果跨越了多种细胞类型，从传统细胞系到3D皮肤模型均得到验证。

作用机制的特异性与交叉性

虽然该技术最初是针对NER途径设计的，但实际检测范围超出了预期。除了B[a]P（苯并[a]芘）、AFB1（黄曲霉毒素B1）等典型庞大加合物诱导剂外，对烷化剂（如MMS、EMS）和氧化剂（如H₂O₂）也表现出良好的检测灵敏度。这种交叉反应性源于NER途径的多功能性——该途径不仅能修复环境诱变剂引起的损伤，还能处理某些内源性氧化损伤。

实验条件的优化空间

抑制剂使用浓度存在明显差异：APC常用1-15μM，HU为1-10mM，而Ara-C的浓度范围较宽（4.1μM-1.8mM）。暴露时间从30分钟到24小时不等，其中共暴露（co-exposure）是最常用的给药方式。值得注意的是，Speit等研究发现APC在30分钟预处理与同时给药间无显著差异，而Odongo等则证实较高浓度（6μM）APC能产生更强的增强效应。

细胞模型的关键影响

不同细胞系对抑制剂的响应存在显著差异。代谢能力成为重要影响因素：Ngo等发现，在代谢惰性的TK6细胞中，B[a]P和AFB1检测结果为阴性，而在代谢活跃的HepaRG细胞中则转为阳性。此外，细胞增殖状态也通过影响DNA聚合酶选择（增殖细胞主要使用Pol ε，静止细胞偏好Pol δ）间接调节检测灵敏度。

讨论部分深入剖析了该技术的优势与局限。虽然三种抑制剂都能有效增强检测灵敏度，但其作用机制均非NER途径专属——APC抑制B家族DNA聚合酶（Pol α/δ/ε/ζ），Ara-C作为链终止剂影响多种聚合酶，HU则通过消耗dNTP库产生协同效应。这种多靶点特性一方面拓展了检测范围，另一方面也挑战了结果解释的特异性。此外，细胞毒性作为潜在干扰因素需要特别关注，尽管79%的基因毒性研究已包含细胞活性检测，但建立适用于抑制剂处理的毒性阈值标准仍需进一步探索。

该研究的重大意义在于确立了DNA修复抑制剂联用技术作为遗传毒性评价工具的地位。不仅为AOP框架提供了实验支持，更推动了彗星试验从单纯的损伤检测向修复功能评估的跨越。未来通过标准化实验条件、扩大化合物验证范围，该技术有望在环境监测、药物安全评价等领域发挥更大价值。正如研究者所言，这项技术使我们得以"窥见"DNA修复的动态过程，为理解化学物质与遗传物质相互作用提供了全新视角。