靶向16S rRNA基因V1-V2区的等温扩增技术快速筛查生乳中李斯特菌属的研究

《International Dairy Journal》：Isothermal assay targeting the V1-V2 region of the 16S rRNA gene for rapid screening of Listeria spp. in raw milk

本文推荐一种创新性环介导等温扩增（LAMP）检测方案，通过靶向16S rRNA基因V1-V2高变区实现生乳中李斯特菌属（Listeria spp.）的快速筛查。该技术突破传统 virulence gene 靶向局限，对单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes）和英诺克李斯特菌（L. innocua）的检测限分别达10 CFU/mL和1000 CFU/mL，与PCR方法一致性指数（Kappa值）达0.74。研究首次证实16S rRNA靶标在LAMP检测中的特异性，为食品病原体监测提供新策略。

　　

亮点

基于李斯特菌属16S rRNA基因V1-V2区的系统发育分析

为了评估16S rRNA基因V1和V2区域能否用于鉴定李斯特菌属，我们对单核细胞增生李斯特菌分离株44和其他相关细菌的序列进行了比对分析。通过美国国家生物技术信息中心（NCBI）的基本局部比对搜索工具（BLAST, 2025），我们搜索了可能存在于牛奶中的细菌（如乳酸菌）的16S rRNA基因V1和V2区域的同源序列。

系统发育分析

我们利用来自不同重要食品细菌、生乳相关细菌以及关键致病菌（包括多种李斯特菌属菌株）的16S rRNA基因V1-V2区域构建了系统发育树。构建完成后，该树清晰地显示了不同细菌属间的分离，菌株按照其分类学分类进行分组。单核细胞增生李斯特菌和英诺克李斯特菌的菌株形成了一个界限分明的单系分支，序列相似性高。

讨论

由于大多数检测单核细胞增生李斯特菌的LAMP方案侧重于扩增毒力基因或与毒力相关的基因，我们的目标是开发一种能够使用非毒力基因作为靶标，来同时鉴定单核细胞增生李斯特菌、英诺克李斯特菌以及其他李斯特菌属物种的方案。此外，我们旨在使用一种非商业化的、简单的核酸提取方案，该方案需与LAMP兼容，并能简便地检测牛奶样品中的李斯特菌属。这一点至关重要，因为商业试剂盒可能价格昂贵，并且在资源有限的环境中不易获得。

结论

合成DNA有助于优化LAMP检测条件，在开发新的病原体诊断方法时无需使用致病菌。通过LAMP扩增的16S rRNA基因V1-V2区域对李斯特菌属具有特异性，允许在纯培养物和生乳中检测单核细胞增生李斯特菌和其他李斯特菌物种；然而，单核细胞增生李斯特菌的存在必须通过PCR来确认。LAMP检测快速（约1.5小时）、易于操作且高度灵敏，使其成为在确认单核细胞增生李斯特菌之前对生乳中的李斯特菌属进行初步筛查的合适工具。