利用多色阴极荧光成像实现单颗粒镧系纳米粒子的纳米尺度光学分析

《Nature Communications》：Multicolor cathodoluminescence imaging of single lanthanide nanoparticles

本研究针对纳米尺度多色阴极荧光(CL)成像中存在的非局部信号干扰难题，通过系统研究镧系纳米粒子(LNPs)的阴极荧光特性，成功实现了直径小至12 nm的单颗粒多色CL成像。研究人员发现并验证了杂散电子导致的非局部激发是影响单颗粒检测的关键限制因素，通过优化样品制备和成像条件，首次实现了同一视野下不同光谱特征LNPs的多色成像，并建立了CL亮度与纳米颗粒尺寸的线性关系。该研究为理解纳米材料的光子响应机制提供了新见解，推动了CL作为高分辨率、多色电子显微镜对比机制的应用发展。

　　

在当今纳米科技蓬勃发展的时代，科学家们对材料光学特性的研究需求日益增长。特别是在细胞生物学领域，纳米尺度成像能够揭示生物分子的精确定位和局部化学环境信息；而在材料科学中，光学特性则为研究电子结构、能量转移与弛豫途径、激子迁移动力学等关键过程提供了重要窗口。然而，传统的光致发光技术面临着一个根本性限制——光的衍射效应使得在可见光谱范围内激发的区域直径无法低于250纳米，这一尺度远远大于生物分子通常定位和相互作用的纳米级维度。

为了突破这一分辨率瓶颈，研究人员已经开发了多种策略。近场显微镜虽然能够实现纳米级分辨率，但仅限于样品表面且成像速度缓慢。超分辨率荧光显微镜方法虽然能够突破衍射极限，但仅适用于能够实现荧光开关控制的特殊探针，无法广泛应用于研究任意材料的本征光学特性。

在这种背景下，阴极荧光(CL)显微镜作为一种颇具前景的纳米尺度分析方法应运而生。这种技术通过电子-物质-光相互作用产生发光，结合了电子显微镜的高分辨率优势和光学发射的敏感性。与电子能量损失谱(EELS)和能量色散X射线分析(EDX)等主要用于元素分析的技术不同，CL对比能够揭示材料对自由电子的纳米尺度光学响应特性。

尽管CL技术具有巨大潜力，但其成像物理机制仍未被充分理解，这限制了其在纳米尺度成像中的应用。特别是实现多色单颗粒CL成像一直是一个重大挑战。先前的研究仅限于单色成像，或多色成像仅限于大尺寸纳米颗粒(>100纳米)。此外，区分同一视野中不同纳米颗粒的CL信号、实现可重复的单颗粒CL强度测量以及建立CL强度与纳米颗粒尺寸之间的清晰关联等方面仍存在挑战。

针对这些挑战，哈佛大学的研究团队在《Nature Communications》上发表了最新研究成果。他们以镧系纳米粒子(LNPs)为模型系统，系统研究了CL成像中的关键限制因素——杂散电子引起的非局部信号。通过减轻这些非局部激发，研究人员成功实现了直径小至12纳米的多色单颗粒CL成像，并建立了CL亮度随纳米颗粒直径单调增加的线性关系。

研究团队采用的主要技术方法包括：定制化的CL成像系统搭建、单分散LNPs的合成与表征、蒙特卡洛电子轨迹模拟分析、多通道CL信号采集与处理、生物样品制备与成像优化等。其中，针对HEK293T细胞的样品处理采用了锇酸(OsO₄)固定和六甲基二硅氮烷(HMDS)干燥的标准电镜制备流程，有效抑制了生物样品的自发阴极荧光(auto-CL)干扰。

非局部激发阻碍单颗粒CL成像

研究人员首先发现在典型的CL成像实验中，尽管单个LNPs表现出明显的光谱稳定性和与SEM图像相匹配的空间分辨率，但LNPs的CL亮度并未与其尺寸呈现预期的单调相关性。这一令人困惑的发现与蒙特卡洛模拟预测的线性关系相矛盾。

更令人意外的是，当研究人员对含有两种不同类型LNPs(NaHoF₄和NaDyF₄)的混合样品进行成像时，尽管单个LNPs仅掺杂单一离子，却在Ho³⁺和Dy³⁺两个颜色通道中都检测到了CL信号。这种现象在光学显微镜中是不合理的，因为它意味着单个荧光团在两个不同的光谱范围内发射。

研究团队推测这种异常现象源于电子显微镜特有的现象：非局部激发。即样品特征(主要是LNP聚集体)虽然位于抛物面镜的视野内，但并未被初级电子束直接激发。为了验证这一假设，研究人员设计了巧妙的实验：在硅晶片上将两种不同颜色的纳米晶体分离，一半覆盖厚厚的发光NaDyF₄ LNPs层，另一半涂布稀疏分散的单个发光NaHoF₄ LNPs。

实验结果证实了非局部激发的存在：当成像距离厚NaDyF₄层边缘200微米以上的单个NaHoF₄ LNPs时，Dy³⁺通道中未观察到CL信号；然而，当成像距离层边缘200微米以内的NaHoF₄ LNPs时，除了预期的Ho³⁺通道信号外，Dy³⁺通道中也检测到了意外信号。这种异常信号随着成像的NaHoF₄ LNPs与NaDyF₄层之间距离的减小而显著增加。

研究人员进一步通过系统实验排除了其他可能机制，如衬底激子扩散或来自激发纳米颗粒的光子发射(X射线或光学)。使用200纳米厚的Si₃N₄层分离稠密NaDyF₄纳米晶体层和稀疏NaHoF₄ LNPs的实验表明，光子发射不是非局部信号的原因。

减轻非局部激发实现多色成像

在识别非局部CL信号的起源和影响后，研究团队开始探索在仅含单个LNPs的样品中是否能够实现多色成像。首先通过蒙特卡洛电子轨迹模拟量化了两个相邻NaHoF₄纳米颗粒之间的激发串扰。模拟结果显示，即使用3 keV电子束激发单个LNP，即使两个纳米颗粒直接接触，沉积到相邻LNP的总能量也不到2%。这种最小的串扰表明，具有密集分布但未聚集的纳米晶体的多色CL成像应该是可行的。

为了实验验证这一计算结果，研究人员优化了样品制备过程以最小化LNP聚集，实现了硅晶片上单个LNPs的二维分布。在这种样品中，研究团队成功实现了紧密相邻的NaHoF₄和NaDyF₄ LNPs的多色CL成像。来自两个纳米颗粒的CL信号在空间上是分离的，这使得它们能够进行光谱分类。

研究人员进一步将CL成像扩展到三色，使用NaHoF₄、NaDyF₄和NaTbF₄ LNPs。这些镧系离子因其最小的光谱重叠而被选择。即使在相邻不同颜色的LNPs附近，单个LNPs仍在光谱不同的通道中发射CL。这些结果证明了在密集分布的单个LNPs样品中进行多色单颗粒CL成像的可行性。

镧系纳米晶体中CL发射的表征

利用单颗粒灵敏度，研究人员确定了在没有非局部激发的情况下LNP亮度随直径变化的规律。他们将CL亮度定义为从纳米颗粒检测到的每秒光子数。对于所有掺杂剂，LNP亮度随其直径单调增加。线性拟合足以描述数据，这表明LNP亮度主要取决于其轴向尺寸。这种线性关系表明在3 keV束能量下，15-30纳米直径LNPs内的电子相互作用体积呈圆柱形。

研究还发现LNP的CL亮度取决于镧系离子的类型。例如，对于20纳米的NaHoF₄纳米颗粒，获得了约1100光子/秒，而NaSmF₄约为600光子/秒。CL亮度对镧系离子类型的依赖性可能源于多种因素的组合，包括吸收截面的差异、主要发射峰中发射的百分比、激发态寿命、电致漂白水平和不同镧系离子的量子产率。

所有掺杂剂的负y截距表明了我们系统中可检测的最小LNPs尺寸的下限。该限制主要由来自Si衬底的CL信号的泊松噪声决定，因为LNPs是在此背景信号之上检测到的。对于四种掺杂剂，研究人员检测到了亚20纳米的LNPs，信噪比(SNR)明显高于非发射对照LNPs在相同光谱通道中的信噪比。

生物样品中的多色单颗粒CL成像

在实现CL测量中的单颗粒灵敏度并表征硅衬底上LNPs的发射特性后，研究人员测试了在生物样品中单颗粒测量的灵敏度。特别是，他们试图确定在培养的哺乳动物细胞表面上LNPs的发射特性。这里的一个关键限制是细胞的自发阴极荧光(auto-CL)，类似于荧光成像中的自发荧光，是未标记细胞被电子束激发时固有的发光。

固定的HEK293T细胞表现出宽谱的自发CL发射，在Dy³⁺和Ho³⁺颜色通道中平均分别约为4300和2700光子/秒。这种自发CL不仅降低了LNPs的信噪比，而且由于成像LNPs时非局部激发自发CL而导致在多个颜色通道中出现意外的CL信号——与图2中呈现的效果类似。研究人员发现锇酸(OsO₄)，一种标准的电镜样品制备固定和染色剂，减少了细胞的自发CL。来自OsO₄处理细胞的自发CL与硅衬底的背景CL相当，表明OsO₄处理是一种有效的化学方法用于抑制背景自发CL。

随后，研究人员测量了沉积在准备用于标准SEM成像的HEK293T细胞表面上的LNPs的CL。样品制备包括OsO₄处理以减轻自发CL，以及溅射涂覆2.5纳米厚的80:20 Pt:Pd混合物以避免样品充电。在这些条件下，研究人员观察到来自LNPs的CL信号大约减少了两倍，这归因于它们在溅射涂覆过程中暴露于等离子体。尽管亮度降低，研究人员仍收集到足够的光子来检测每个成像的亚20纳米单LNP。

最后，研究人员在HEK293T细胞表面上进行了NaHoF₄和NaDyF₄ LNPs的多色成像。即使在溅射涂覆后，LNPs在SEM图像中产生的对比度也比细胞特征更强。这种对比度允许它们在SEM图像中进行精确定位，这是单颗粒分析所必需的。与硅衬底上的CL成像类似，生物样品中的分辨率由聚焦电子束的大小决定，每个LNP的位置和光谱特性以及细胞超微结构被同时可视化。

研究结论与意义

本研究系统识别并解决了由杂散电子引起的非局部CL信号这一关键限制因素，为实现纳米尺度多色CL成像奠定了坚实基础。通过以镧系纳米晶体为模型系统，研究人员不仅揭示了非局部激发的物理机制，还建立了可靠的单颗粒检测标准：CL速率随LNP尺寸单调增加，以及同一视野下的多色单颗粒成像能力。

该研究的创新性主要体现在以下几个方面：首先，首次系统阐明了CL成像中非局部信号的产生机制和影响范围，为改进CL技术提供了理论指导；其次，建立了单颗粒CL亮度与尺寸之间的定量关系，为纳米材料的光学特性研究提供了新方法；第三，成功将多色CL成像技术应用于生物样品，证明了其在生物医学研究中的实用价值。

这项研究的成功不仅推动了CL显微镜技术的发展，更为纳米尺度光学分析开辟了新途径。在材料科学领域，该技术可用于研究半导体纳米缺陷和能带结构；在量子信息科学中，可实现量子波函数中初始电子-空穴对的局部激发；在生物成像方面，CL对比为获得分子信息以及电子显微镜提供的超微结构细节提供了有用工具。特别是镧系纳米晶体作为蛋白质标记的应用前景广阔，因其在电子激发下具有稳健的发射特性。

总之，这项研究通过深入理解CL成像物理机制并开发有效的实验策略，成功实现了纳米尺度多色单颗粒CL成像，为跨学科领域的局部纳米尺度光学特性表征提供了高分辨率、自由电子基础的光致发光补充技术。研究成果对推动纳米科技在生物医学、材料科学等领域的应用发展具有重要意义，为未来纳米尺度光学研究提供了新的技术平台和方法学基础。