用于早期准确诊断登革病毒感染的工程化纳米抗体

《PLOS Pathogens》：Engineered Nanobodies for early and accurate diagnosis of dengue virus infection

登革热病毒（DENV）的传播在阿根廷等地呈上升趋势，传统诊断方法存在成本高、灵敏度不足等问题。本研究通过免疫骆驼并筛选特异性纳米抗体（Nb），结合双抗体夹心ELISA法（cNb-ELISA）开发新型诊断工具。优化后系统以Nb14 Fc为捕获抗体，Nb48或Nb66为检测抗体，在检测血清型1-2的NS1蛋白时表现出93.6%的敏感性、81.1%的特异性（AUC=0.94），且可识别症状后5天内的感染样本。然而，对血清型4的检测灵敏度较低，且存在部分样本与商用试剂盒结果不一致的情况。该系统成本低、操作简便，为资源有限地区提供了可行的替代方案，但需进一步优化以提升全面性和准确性。

　　随着全球气候变化、人口增长、旅行活动增加以及废弃物管理不善等因素的推动，登革热（Dengue）作为一种由蚊媒传播的黄病毒，已经成为全球公共卫生领域的一个重大挑战。在阿根廷，登革热已从一种偶发性疾病演变为频繁的流行病，目前影响了该国23个省中的18个，暴露出诊断能力方面的不足。面对这一公共卫生危机，迫切需要开发更高效、低成本的诊断工具，以支持快速、准确的检测，并在流行病暴发时提高应对能力。

登革热病毒（DENV）共有四个血清型：DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4，这些血清型之间具有一定的氨基酸和核苷酸同源性。NS1蛋白是DENV的重要生物标志物，其在感染的急性期被分泌到血液中，能够在发热症状出现后的第一天即被检测到，并在大多数患者体内持续至7-9天，甚至有报道指出其可检测至第18天。NS1蛋白的高浓度（0.4至10 μg/mL）使其成为早期诊断的理想靶点，同时其水平与疾病严重程度相关，因此在诊断和预后评估中具有重要价值。然而，传统的诊断方法存在诸多限制，如成本高、操作复杂、需要专业实验室和受过培训的人员，这使得它们在资源有限的地区难以广泛应用。

为了解决这些挑战，研究团队开发了一种基于纳米抗体（Nanobody）的组合酶联免疫吸附试验（cNb-ELISA），利用纳米抗体对NS1蛋白的特异性结合能力，以提高检测的敏感性和特异性。纳米抗体是从骆驼科动物中发现的一种单域抗体，具有独特的结构特点，即缺乏轻链和CH1结构域，仅由重链组成。它们具有高度的特异性和亲和力，可以被用于多种病原体的检测和抑制。研究中选取了能够识别所有四个DENV血清型NS1蛋白的纳米抗体，并对其进行了优化，以提升其作为捕获抗体或检测抗体的性能。

在研究中，纳米抗体的生产过程涉及将DENV各血清型的NS1蛋白作为抗原，对骆驼进行多次免疫，并通过生物亲和筛选（biopanning）和分子克隆技术，从中筛选出能够特异性结合NS1蛋白的纳米抗体。随后，这些纳米抗体经过进一步的结构修饰，如添加聚苯乙烯结合肽（PSW）以提高其在微孔板上的结合能力，以及构建双价或Fc融合蛋白以增强其检测性能。通过使用两种不同的生物素化策略，研究团队成功地开发出能够用于检测的纳米抗体，并验证了其在实际临床样本中的应用潜力。

研究结果显示，cNb-ELISA具有优异的诊断性能，其曲线下面积（AUC）超过0.9，诊断敏感性达到93.6%（95% CI：86.6–97.6%），特异性为81.1%（95% CI：70.3–89.3%）。该检测系统能够有效识别患者在发热症状出现后五天的病例，这些病例在传统流行病学算法中被标记为阴性，但在实际检测中显示出感染迹象。这一发现凸显了现有诊断算法在识别晚期呈现病例方面的不足，强调了开发更灵敏的诊断工具的必要性。

此外，研究团队还评估了cNb-ELISA在不同DENV血清型样本中的检测能力。结果显示，该系统在检测DENV-1和DENV-2时表现出较高的灵敏度，但在DENV-3和DENV-4中检测能力相对较弱。这可能与DENV-4的NS1蛋白在结构和免疫原性上的独特性有关，导致现有纳米抗体对它的识别能力不足。因此，未来的研究需要进一步优化纳米抗体的特异性，以确保其对所有DENV血清型的检测能力。

在诊断能力验证方面，研究团队利用来自阿根廷奥兰医院的94份NS1阳性样本和74份流行病学阴性样本，对cNb-ELISA的性能进行了评估。结果显示，该检测系统的诊断敏感性和特异性均较高，且与官方诊断算法的Kappa值达到0.75，表明其在实际应用中具有良好的一致性。然而，由于样本量的限制，无法对所有样本进行完整的验证，这可能影响了诊断特异性的进一步提升。

尽管cNb-ELISA在实际样本中表现良好，但其在某些情况下仍存在局限性。例如，对于DENV-4的检测能力较弱，这可能与该血清型的NS1蛋白结构差异或免疫复合物形成有关。免疫复合物可能掩盖NS1蛋白的表位，从而影响纳米抗体的结合能力。为了提高检测效率，研究团队尝试了多种免疫复合物解离策略，包括改变pH值和使用热处理，但未能显著改善检测结果。这表明，传统的免疫复合物解离方法在某些情况下可能不够有效，未来需要探索更高效的策略。

研究还发现，纳米抗体在检测低浓度的NS1蛋白时表现优异，但在实际临床样本中的检测能力受限。这可能是由于临床样本中NS1蛋白的构型与实验室中使用的重组蛋白存在差异，导致纳米抗体无法有效识别。因此，未来的研究应考虑使用更接近真实临床样本的材料，如患者血清，以提高纳米抗体的检测能力。

在成本和可及性方面，cNb-ELISA相较于传统的商业诊断试剂具有显著优势。纳米抗体的生产可以通过细菌表达系统实现，这不仅降低了生产成本，还提高了其在资源有限地区的应用潜力。此外，该检测方法操作简便，无需复杂的设备或专业人员，适合在基层医疗机构中推广使用。这些特点使得cNb-ELISA成为一种潜在的、可持续的诊断工具，尤其适用于阿根廷等资源有限的地区。

研究团队还探讨了纳米抗体在不同诊断策略中的应用，包括单价抗体、双价抗体和Fc融合蛋白。结果显示，Fc融合蛋白在提高检测灵敏度方面具有显著优势，但其生产成本较高，需要依赖哺乳动物细胞表达系统。相比之下，双价抗体在细菌系统中可以高效生产，且在某些情况下表现出良好的检测性能。因此，开发低成本、高效率的纳米抗体检测系统对于提升公共卫生诊断能力至关重要。

在实际应用中，cNb-ELISA表现出良好的检测性能，特别是在识别晚期病例方面。这种能力对于流行病的早期干预和控制具有重要意义，因为晚期病例往往容易被漏诊，从而影响疫情的防控效果。此外，该系统能够检测到NS1蛋白的浓度范围与人类样本中报告的浓度一致，表明其具有良好的分析灵敏度。

总的来说，这项研究为登革热的诊断提供了一种新的解决方案，即基于纳米抗体的组合ELISA系统。该系统不仅在检测性能上表现出色，还具有成本效益和操作简便的优势，适合在资源有限的地区推广使用。然而，进一步的优化和验证工作仍需进行，以提高其对所有DENV血清型的检测能力，特别是在DENV-4方面的表现。此外，还需要考虑免疫复合物的影响，以及如何在实际临床环境中有效应用该检测系统。通过持续的研究和改进，基于纳米抗体的诊断工具有望成为应对登革热流行病的重要手段，为公共卫生政策的制定和实施提供科学支持。