综述：小鼠骨肉瘤模型：揭示疾病机制并加速药物发现与开发

《Cancer Reports》：Mouse Models of Osteosarcoma: Unraveling Disease Mechanisms and Accelerating Drug Discovery and Development

这篇综述系统梳理了骨肉瘤（OS）小鼠模型的研究进展，重点阐述了转基因（TMM）、原位（orthotopic）、异位（heterotopic）、患者来源异种移植（PDX）及人源化（humanized）模型在揭示OS疾病机制、评估纳米药物（NP）、免疫检查点抑制剂（如PD-1/PD-L1轴）、靶向疗法（如靶向c-MYC、p53-MDM2相互作用、CSF-1抑制剂PLX3397等）及克服传统细胞毒性药物局限性方面的关键作用，为加速OS新药研发提供了重要 preclinical 见解。

　　

ABSTRACT

骨肉瘤（OS）是最常见的原发性恶性骨肿瘤，主要影响儿童、青少年和年轻成人。过去40年间，由于缺乏超越传统细胞毒性药物的系统性治疗选择，骨肉瘤患者的生存率改善甚微。转移性和复发性疾病的治疗尤其仍是重大的临床挑战。

近年来，骨肉瘤小鼠模型已成为研究疾病生物学、转移和对新疗法反应的重要工具。这些模型被用于评估多种创新药物的疗效，包括能够靶向骨肉瘤肿瘤细胞递送药物并减少脱靶效应的纳米颗粒（NP）制剂。此外，借助小鼠模型，骨肉瘤的免疫检查点抑制剂和免疫疗法在临床前研究中也取得了显著进展。

本综述深入探讨了文献中描述的各种骨肉瘤小鼠模型（包括转基因、原位、异位模型以及患者来源异种移植PDX）的优势与不足，并重点介绍了这些模型如何被用于支持专注于开发新疗法的临床前研究。

1 Introduction

骨肉瘤（OS）是骨癌中最常见的形式，最常发生于10-24岁的儿童和年轻人中，在65岁以上的成年人中有一个较小的发病高峰。总体而言，OS是一种相对罕见的恶性肿瘤，占儿童癌症的3%。男性罹患骨肉瘤的频率更高，并且在各年龄段的总生存期均较女性差。OS通常发生在生长板附近长骨的干骺端，其中股骨远端和胫骨近端是最常受累的部位。OS的一线治疗包括强化新辅助化疗和肿瘤手术切除。局限性疾病患者的5年生存率约为70%，而有远处转移的患者生存率则降至30%以下。约15%-20%的患者在诊断时即有可检测到的转移性疾病，其中85%的转移病例发生在肺部。尽管许多患者对初始治疗反应良好，但复发率高达近25%，且复发患者预后差。遗憾的是，尽管进行了深入的临床前研究和大量临床试验，OS的生存率在过去四十年中基本保持不变。在其他癌症类型中证明有益的新型治疗选择，如免疫疗法和靶向药物，尚未在OS中成功应用。因此，迫切需要开发治疗OS的新策略。使用能密切模拟人类疾病的可靠小鼠模型进行临床前研究对于实现这一目标至关重要。

小鼠自发性发生OS的概率低于1%，因此小鼠肿瘤模型对于研究疾病进展、转移和药物反应至关重要。理想的临床前模型不仅应模拟人类OS的遗传和组织学特征，还应允许及时评估药物反应和毒性。最终目标是找到具有转化潜力的模型。

2 Transgenic Mouse Models

转基因小鼠模型（TMMs）具有多种优势，包括能够操纵特定基因的表达以识别人类疾病的驱动因素。它们还允许在免疫健全的动物中研究肿瘤发生、疾病进展和药物反应。尽管有其优势，但一些TMMs也存在缺点，如潜伏期长、外显率降低以及开发成本高。此外，与人类OS的差异，包括转移潜力和肿瘤发生部位，限制了它们在临床前研究中的应用。

1993年，第一个OS的TMM——H2-fosLTR小鼠被开发出来。该模型依赖于过度表达原癌基因c-fos来促进肿瘤发生。尽管c-fos广泛表达于多种组织，但小鼠仅会发展成OS，并确定成骨细胞为起源细胞。OS发展迅速，早在4周龄时即可在X光片上发现肿瘤。遗憾的是，该模型缺乏转移潜力，这可能是由于疾病进展迅速和小鼠寿命短所致，限制了其在药物开发中的应用。

大多数OS的TMMs依赖于肿瘤抑制蛋白p53编码基因Trp53的杂合或纯合条件性缺失。早期研究表明，约22%的人类OS病例存在Trp53突变，而随后的全基因组测序显示，95%的OS肿瘤中存在p53通路的功能失活突变。Trp53失活的普遍性与OS中观察到的高度基因组不稳定性相关。在间充质干细胞（Prx1-cre;P53^lox/lox）或成骨细胞（Col1a1-cre;p53^lox/lox 或 Col3.6-Cre;p53 ^lox/lox）中条件性纯合缺失Trp53会促进小鼠发生OS，潜伏期约为9个月至1年。Trp53杂合缺失（Prx1-cre p53^lox/+）也会导致小鼠发生OS，但会将潜伏期延长至约2年。杂合缺失Trp53后也观察到胸腺淋巴瘤、肺癌、鳞状细胞癌和乳腺癌。OS肿瘤主要发生在肢体骨骼，这是该模型的一个优势，因为它模拟了人类OS的发展。虽然这些模型为理解OS起始和进展的分子通路提供了见解，但长潜伏期限制了它们在药物开发研究中的应用。

开发TMM的其他策略涉及将p53缺陷与另一个肿瘤抑制基因（如Wwox或Rb1）的缺失相结合，以增强OS发展并缩短潜伏期。在成骨细胞中条件性缺失Wwox和Trp53（Osx1Cre⁺;Wwox^fl/+p53^fl/fl）会导致小鼠在4个月内发生OS。同样，在间充质干细胞（Prx1-cre p53^lox/lox Rb^lox/lox）或成骨细胞（Osx1-Cre;Rb1^lox/lox;p53^lox/lox）中条件性双敲除（DKO）Trp53和Rb1会导致小鼠在4-5个月内发生OS。Osx1-Cre;Rb1^lox/lox;p53^lox/lox TMM重现了人类OS的许多特征，如细胞遗传学复杂性、转录谱和组织学特征。有趣的是，虽然在一些小鼠的肢体骨骼中观察到肿瘤发展，但大多数Trp53/Rb1 DKO小鼠（76%）在通常人类OS不常见的部位（如下颌、口鼻和头部）发生肿瘤。与单一的Trp53敲除相比，Trp53/Rb1 DKO小鼠的转移发生率也较低。此外，50%在成骨细胞中纯合缺失Rb1和Trp53的小鼠发生了神经内分泌起源的肿瘤，表明Osx1-Cre转基因在神经内分泌组织或前体细胞中低水平表达。Rb1杂合缺失（Osx1-Cre;Rb1^+/lox;p53^lox/lox）延长了潜伏期但降低了神经内分泌肿瘤的发生率。单独缺失Rb1后未观察到OS，表明Trp53突变是关键性的，而Rb1突变仅增强了OS的发展。

MYC癌基因，也称为c-MYC，属于一个转录调节因子超家族，控制着参与细胞周期调控、信号转导、代谢、转录和蛋白质合成等基本细胞过程的众多蛋白质编码和非编码基因的表达。超过一半的人类癌症中存在MYC基因位点的异常或MYC通路的失调。约20%的OS肿瘤含有8q24位点的重复，该位点包含c-MYC癌基因。为了阐明c-MYC在OS发展中的作用，Nirala等人构建了一个成骨细胞特异性c-MYC敲入TMM。c-MYC敲入小鼠快速发生OS（中位生存期24周），肺转移发生率高（>60%）。此外，c-MYC的过度表达导致microRNA 17/20a表达增加，进而引起巨噬细胞集落刺激因子1下调并减少肿瘤浸润巨噬细胞。这些结果提供了机制上的见解，说明MYC信号如何允许肿瘤细胞破坏其微环境并逃避免疫系统的检测。

一些不依赖p53的TMMs也被开发出来。这些模型利用了致癌驱动因子，如Notch1、APC和hedgehog信号通路。Col1a1 2.3 kb-Cre; Rosa26^NIC (NICD) 转基因驱动Notch1胞内结构域在成骨细胞中的过度表达。存活的NICD小鼠在5至14月龄间自发发生OS、骨瘤或两者兼有。删除Trp53（Col1a1 2.3 kb-Cre; Rosa26^NICD; Trp53^Flox/Flox）加速了NICD小鼠的肿瘤起始和进展，这些肿瘤与人类OS共享重要特征，包括组织病理学、细胞遗传学复杂性和转移潜力。对一组儿科OS患者的检查发现，对骨骼发育重要的调节因子TWIST和APC基因频繁且同时缺失。同时具有TWIST单倍体不足和突变Apc^1638N等位基因杂合表达的小鼠（Apc1638^N/+; twist^null/+）发生OS肿瘤，但外显率不完全且潜伏期相对较长（许多情况下>15个月）。大多数小鼠在头部区域发生肿瘤。鉴于hedgehog信号在肿瘤发展中的相关性，Chan等人生成了一个在成熟成骨细胞中hedgehog信号上调的小鼠模型，并将其与Trp53杂合背景杂交以增强肿瘤发展。所得小鼠（HOC-Cre; Ptch1^c/+; p53^+/-）在前肢、胫骨和股骨出现可见肿瘤，颅骨受累较少。虽然这些模型为OS的分子驱动因素提供了见解，但由于其长潜伏期和低外显率，它们尚未被用于药物开发工作。

3 Orthotopic Mouse Models

原位小鼠模型通过将OS细胞注射到骨旁（骨旁）或直接注射到股骨或胫骨骨干（骨内）来实现。骨内模型最好地重现了人类OS中观察到的肿瘤微环境，但在技术上最具挑战性且需要麻醉。这些模型是通过将小鼠OS细胞系注射到同系小鼠（例如：BALB/C小鼠中的K7M2细胞）或将人类OS细胞系注射到免疫缺陷小鼠（例如：裸鼠或NOD/SCID小鼠中的143B细胞）中产生的。OS细胞系通常被设计为表达荧光素酶，以便进行生物发光成像和监测肿瘤生长。可用于研究的OS细胞系种类繁多以及文献中对原位模型的详细描述是关键优势。

几种细胞系是从野生型小鼠自发性OS肿瘤中建立的。利用这些细胞系建立原位小鼠模型使研究人员能够在免疫健全的动物中研究OS，这对于评估新型免疫调节药物至关重要。K7M2细胞注射到C57Bl/6小鼠胫骨后能快速形成肿瘤，并显示出高肺转移潜力。重要的是，早期手术切除接种的肢体并不影响转移负荷。另一个模型涉及将MOS-J细胞注射到同系C57Bl/6小鼠中。Crenn等人比较了三种常用化疗药物（阿霉素、顺铂、异环磷酰胺）在骨内和骨旁建立的MOS-J肿瘤中的治疗反应。与骨旁肿瘤相比，骨内肿瘤小鼠对阿霉素的治疗反应有显著益处，表明微环境在OS对化疗的反应中起作用。这些结果凸显了在可能的情况下，在药物开发中使用骨内模型的重要性。

Dunn细胞系源自CH3/HeN小鼠自发性OS肿瘤，并已被用于开发几种额外的细胞系（LM8、DLM8-M1和POS-1）。LM8细胞因其高肺转移定植能力而被筛选出来，即使在皮下（subQ）移植后也会发生肺转移。DLM8-M1细胞也具有高转移潜力，在CH3/HeN小鼠胫骨内注射后5周内形成肿瘤。POS-1细胞已被用于皮下和骨旁异种移植。

使用人类OS细胞系的原位模型常规用于药物发现研究。HOS细胞系于1971年从一名13岁OS患者的肿瘤中建立，多年来经过体外修饰产生了几个细胞系变体，包括143B、KRIB、MNNG/HOS和KHOS。143B和KRIB都是高转移性OS细胞系，当骨内注射时会播散到肺部，从而使研究人员能够研究新型药物对转移性疾病的作用。这些模型的主要缺点是其侵袭性强，给研究人员研究药物反应的窗口期很窄。例如，胫骨内注射KRIB细胞在2周内产生可触及的肿瘤，6周内发生肺转移。为了延长生存时间，必须在8周时通过手术切除原发肿瘤。类似地，胫骨内注射143B细胞的小鼠在4周时达到终点。MNNG/HOS和KHOS细胞系在骨旁注射时都能在裸鼠中轻易形成肿瘤。重要的是，MNNG/HOS、143B和KHOS细胞形成高度溶骨性病变，使研究人员能够评估疗法对OS介导的骨丢失的影响。其他人类OS细胞系也已用于原位小鼠模型，包括MG63、SaOS-2、LM7和G-292。

4 Heterotopic Mouse Models

异位模型涉及将肿瘤细胞系注射到免疫缺陷小鼠的皮下（最常见的是胁腹）空间。虽然这些模型不能重现肿瘤的自然环境，但它们允许更精确地测量肿瘤生长，并且相对易于执行和复制。通常，异位模型不表现出转移潜力。一个显著的例子是SJSA-1细胞系，它容易在裸鼠胁腹生长，是研究药物疗效的有用工具。Lauvrak等人通过将100万个OS细胞接种到NCG小鼠胁腹，评估了22个人类OS细胞系的体内生长情况。根据细胞系在小鼠中的生长速度将其分组，包括高致瘤性细胞系（OSA, 143B, HOS, HOS-MNNG, MHM, OHS）、致瘤性（Cal72, HAL, ZK-58, KPD, G-292, SaOS-2）、低致瘤性（MG63, IOR/OS15, U2OS）和非致瘤性细胞系（IOR/OS18, IOR/OS10, IOR/SARG, 11 T245, IOR/MOS）。

5 PDX Models

患者来源异种移植（PDX）涉及将人类原发性OS肿瘤移植到免疫缺陷小鼠中。该模型被广泛用于OS治疗药物的研究，近年来已有超过100种化合物通过PDX模型进行评估。通常，这些模型是通过将小块肿瘤组织（2 mm3）皮下植入胁腹或通过将酶分离的肿瘤细胞注射到骨旁或骨内部位来实现的。PDX模型的主要优势是它们携带与人类原发肿瘤相同的遗传和表观遗传修饰。它们还允许在已知对标准疗法耐药的肿瘤中评估新药的疗效。这些模型的局限性包括可用性缺乏、移植成功率低以及无法复制人类OS的免疫学复杂性。

重要的是，在这些模型中观察到的疗效可能无法可靠预测临床试验中的治疗益处。抗体药物偶联物glembatumumab vedotin和化疗药物eribulin就是这样的情况，两者在PDX模型中均显示肿瘤生长减缓，但在人类临床试验中未能显示出显著反应。同样，曲妥珠单抗德鲁替康（T-Dxd），一种靶向HER2的人源化单克隆抗体与拓扑异构酶1抑制剂的偶联物，在7个PDX模型中的6个显示能减缓肿瘤生长。然而，一项评估T-Dxd在HER2+ OS患者中有效性的II期临床试验未能证明足够的反应；因此该研究被终止。临床前数据与临床试验结果之间缺乏一致性可能由多种因素造成，例如与免疫系统的相互作用、肿瘤的异质性以及小鼠和人类之间在药代动力学、生物分布或毒性特征上的差异。

PDX异种移植的异位植入也可能导致临床前研究中观察到的假阳性（或假阴性），因为这种方法无法重现肿瘤的原始微环境。将PDX肿瘤移植到骨内或骨周围（通常称为PDOX模型）已成功用于OS的各种临床前药物开发研究。与皮下胁腹肿瘤相比，将完整的人类肿瘤样本植入胫骨允许在大多数小鼠中检测到远处转移。总体而言，PDX模型对研究人员来说是一个有价值的工具，但不能完全依赖它们来预测临床成功。

对高度传代的OS细胞系可靠再现人类OS特征能力的担忧促使了PDX来源的肿瘤细胞系的开发。在这些研究中，人类OS样本首先被植入NOD scid gamma (NSG) 小鼠的肾包膜下，在充分生长后，通过胁腹异种移植传代肿瘤，然后在培养物中生长。重要的是，与原发性肿瘤相比，所得的PDX来源细胞系表现出相似的基因表达模式和基因组景观。PDX来源的细胞系在正交截肢模型中的转移能力是异质性的。此外，dinaciclib，一种CDK2/5/9抑制剂，在移植了携带MYC扩增的PDX来源细胞系的小鼠中能有效减少转移负荷。虽然这些细胞系重现了OS患者样本中观察到的重要特征，包括遗传景观和转移能力，但高昂的成本和开发所需的大量时间限制了它们在研究界的可及性。

6 Humanized Mouse Models

由于人类和小鼠免疫系统存在差异，即使是免疫健全的小鼠模型也可能无法准确重现影响人类OS发展和治疗反应的免疫环境。这一事实促使研究人员采用人源化小鼠模型，即在建立肿瘤异种移植之前，用人类免疫细胞重建免疫缺陷小鼠。Ko等人使用移植了人类CD34+造血干细胞的NSG小鼠成功开发了OS的人源化小鼠模型。他们表明，KHOS/NP肿瘤生长受到更高水平的人类免疫细胞（特别是T细胞）移植的影响。在另一项使用人源化小鼠和KHOS异位异种移植的研究中，研究人员显示，在使用免疫检查点抑制剂nivolumab治疗的小鼠中，CD4+和CD8+ T细胞的肿瘤浸润增加，肺转移减少，但未观察到对原发肿瘤生长的影响。使用CD34⁺干细胞和肿瘤细胞系的类似人源化小鼠模型被用于研究其他骨和软组织肉瘤，包括尤文氏肉瘤。

为了开发临床相关的人类骨微环境，Wagner等人通过将嵌入骨形态发生蛋白-7（BMP-7）纤维蛋白基质的人类骨盆骨和骨髓碎片植入NOD-SCID小鼠，生成了人源化组织工程骨器官（hTEBO）。流式细胞术证实人类造血干细胞和白细胞在人源化微环境中存活。经过10周的皮下生长后，将表达荧光素酶标记的人类SaOS-2细胞注射到hTEBO中。观察到肺转移，并且肿瘤的预后标志物，包括VEGF、骨膜素和HIF2α表达，与人类OS一致。总体而言，该模型减少了人类和小鼠之间的种间差异，并重现了OS骨微环境，为转化研究提供了一个新模型。

据我们所知，OS的人源化PDX/PDOX小鼠模型尚未在文献中描述，但代表了开发可靠小鼠模型的重要下一步。虽然人源化小鼠在OS临床前研究中的应用仍处于起步阶段，但它们代表了研究人类免疫细胞与肿瘤之间相互作用并评估新型免疫疗法的强大工具。

7 Recent Advances in OS Preclinical Drug Discovery

尽管大多数患者对传统细胞毒性化疗显示出良好的初始反应，但由于耐药性的产生和不良副作用，治疗常常失败。药物开发领域对利用纳米颗粒（NP）制剂非常感兴趣，这些制剂可以靶向将药物递送至肿瘤细胞并减少脱靶效应。该策略被用于创建一种新型的叶酸受体靶向的阿霉素（DOX）和edelfosine负载的脂质-聚合物杂合纳米粒。靶向NPs在MG-63胁腹异种移植中显示出增强的OS细胞内化并显著抑制肿瘤生长。在类似的研究中，评估了负载DOX并用波形蛋白结合肽标记以引导OS细胞靶向的纳米颗粒的体内效果。这些NP制剂在143B异种移植中显著降低了肿瘤负荷，并减少了DOX对主要器官的毒性。在另一项研究中，生成了一种治疗性钆基金属-双膦酸盐NP（OVA-GdZol NPs），并在K7M2原位小鼠模型中与放疗联合使用。OVA-GdZol NPs和X射线辐射减少了小鼠的肿瘤体积，延长了生存期，减少了肺转移，同时还促进了骨髓来源树突状细胞的成熟和巨噬细胞的M1极化。通过作为放射增敏剂，这种方法有潜力克服OS中观察到的放射抗性。最后，最近开发了携带NF-κB必需调节剂结合域肽的骨靶向纳米颗粒，并进行了体内评估用于骨肉瘤治疗。靶向NPs在143B原位异种移植中有效抑制了肿瘤生长和骨肉瘤诱导的骨破坏。总之，NPs是开发靶向治疗的一种有前景的方法。

OS免疫检查点抑制剂和免疫疗法的发展受到该恶性肿瘤低免疫原性和免疫抑制微环境的严重阻碍。在一个新方法中，Ge等人开发了一种名为CBZP的NP制剂，其中包含用于激活自噬的姜黄素和用于抑制PD-1/PD-L1轴的BMS1166。CBZP不仅在K7M2原位小鼠模型中 drastically 减少了肿瘤生长，而且预先的CBZP治疗在重新接种K7M2细胞的小鼠中赋予了强大的免疫记忆效应。值得注意的是，先前在多项临床试验中尝试将PDL-1抑制剂用于OS治疗均告失败。也许将免疫原性细胞死亡（通过诱导自噬）与免疫检查点阻断（通过PDL-1抑制剂）相结合可以提供协同效应，从而有效地将PDL-1疗法应用于治疗OS。虽然上述例子突出了NP药物开发在OS方面的最新进展，但还有几项研究表明NPs在一系列OS小鼠模型中具有优异的抗癌活性。

由于肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）具有促肿瘤特性，例如分泌促血管生成生长因子和免疫抑制细胞因子，因此开发靶向TAMs的疗法引起了相当大的兴趣。巨噬细胞集落刺激因子1（CSF-1）是TAMs存活、增殖和分化的主要调节因子。在临床前研究中，CSF-1抑制剂PLX33987被证明能在原位（LM8和OSA）和PDX小鼠模型中抑制原发肿瘤生长和肺转移。此外，PLX3397治疗耗竭了TAMs和FOXP3⁺调节性T细胞，并增加了CD8⁺ T细胞在原发和转移OS部位的浸润。PLX3398，也称为pexidartinib，最近被FDA批准用于治疗腱鞘巨细胞瘤（TGCT）。虽然目前尚无针对pexidartinib治疗OS的临床试验，但临床前数据表明该药有潜力作为OS的新疗法。

近年来开发了几种小分子抑制剂，并在OS小鼠模型中进行了评估。Chessari等人鉴定出两种有效的、选择性的、口服有效的p53-MDM2蛋白质-蛋白质相互作用抑制剂。两种抑制剂在SJSA-1异位异种移植模型中均显示出良好的药效学效应和抗肿瘤功效。在另一项研究中，MTH1的小分子抑制剂TH1579在MNNG/HOS骨旁异种移植模型中减缓了肿瘤生长并减少了肺转移的发生。最后，Zou等人将4-乙酰胞苷乙酰转移酶10（NAT10）确定为一个候选治疗靶点，并指出其与OS患者的不良预后相关。他们证明抑制NAT10在PDX模型中能抑制OS进展。总之，这些研究确定了可用于药理学抑制的新靶点，这些靶点可能成为OS的可行治疗方法。

8 Conclusion

OS临床前研究的主要目标是开发能够转化到临床并使患者受益的疗法。小鼠模型是研究OS发生、发展、转移和治疗反应不可或缺的工具。虽然文献中描述了多种小鼠模型，但并非所有模型都独特地适用于药物开发研究。潜伏期、外显率和肿瘤位置等因素限制了转基因小鼠模型在药物发现领域的用处。使用小鼠或人类OS细胞系的原位和异位模型，以及PDX模型，是OS临床前研究的主力。然而，它们也有局限性，因为它们常常无法重现人类疾病中观察到的复杂肿瘤和免疫微环境。

总体而言，使用单一小鼠模型并非研究具有复杂遗传景观和表型恶性肿瘤的最佳方法。此外，在单一小鼠模型中评估一种药物不太可能预测下游临床试验中的患者结局。虽然此类假阳性已有记载，但这种有限的方法也可能产生假阴性。关于临床前药物开发，鼓励互补使用多种小鼠模型，重点放在能提供骨微环境（原位、TMM、PDOX）、免疫健全动物（同系原位或异位、TMM）或两者兼有（人源化原位模型）的模型上。在可能的情况下，应优先考虑PDOX模型而非PDX模型。

展望未来，持续开发能准确复制人类OS独特肿瘤微环境和免疫相互作用的小鼠模型对于转化研究至关重要。人源化小鼠模型的进一步发展将有助于解读人类免疫细胞在OS肿瘤发生和治疗反应中的作用。人源化小鼠也可能允许免疫疗法的持续发展，这些疗法在其他癌症治疗中已证明极其成功，但在OS中却探索不足。最后，利用新兴技术（如CRISPR/Cas9基因编辑和单细胞测序）的未来研究可能识别出可被药理学利用以开发新疗法的靶点。