通过先沉淀后合成方法，对包含1200个成员的丙烯酰胺库进行深度分析，以用于共价药物发现

《Green Chemistry》：Precipitation-first synthesis and deep profiling of a 1200-member acrylamide library for covalent drug discovery

降低分子量化合物筛选库的建立是早期药物发现的基础，但合成毫克级共价抑制剂库仍受限于纯化步骤资源消耗大、溶剂消耗高和扩展性差的问题。本研究提出一种基于改良Ugi四组分反应的高通量合成工艺，利用氨和丙烯酸替代传统胺源，通过直接沉淀法替代色谱纯化，在常规实验室设备上实现每96孔板每天4次的高效合成，总溶剂消耗降至10升。通过1H NMR、UPLC-MS-UV和AEMS三种互补分析方法，系统评估了1235个丙烯酰胺化合物的纯度（>80%）、结构身份和长期稳定性（两年后94%保持稳定）。开发的PeakSel?平台实现了化合物质量与稳定性的全面分析，为可持续药物库的生成提供了新范式

　　在药物研发的早期阶段，低分子量（LMW）化合物筛选库仍然是发现新药的关键工具。然而，目前在大规模并行合成这些化合物库时，尤其是对于共价抑制剂而言，仍然面临诸多挑战。传统的合成方法往往依赖于资源消耗大、溶剂使用量高以及难以扩展的色谱纯化步骤，这不仅增加了成本，也限制了其可持续性和效率。为了解决这些问题，本研究提出了一种创新的高通量、无需色谱纯化的合成与分析流程，成功合成了1235种丙烯酰胺化合物，并通过多种分析技术对其质量、身份和长期稳定性进行了系统评估。该方法不仅显著减少了溶剂和能源的使用，还提升了合成的可持续性，为共价药物研发提供了一种新的、高效的解决方案。

丙烯酰胺作为一种广泛使用的电亲基团，因其能够与蛋白质中具有亲核性的半胱氨酸残基形成共价键而受到重视。近年来，基于丙烯酰胺的共价抑制剂库在药物研发中变得越来越重要，许多已上市的药物如RAS G12C抑制剂Sotorasib和Bruton激酶抑制剂Ibrutinib都采用了类似的策略。然而，现有的共价库合成方法仍然存在局限，尤其是在大规模生产高质量化合物时，需要复杂的纯化过程。为了克服这些限制，研究团队引入了一种改进的Ugi四组分反应（U-4CR），通过使用氨和丙烯酸作为反应组分，构建了一个新型的合成体系。

Ugi四组分反应是一种在药物筛选库合成中广泛应用的多组分反应技术，其优势在于能够快速生成结构多样的化合物，并且具有良好的功能团兼容性。然而，传统U-4CR方法通常需要使用色谱纯化步骤，这不仅增加了实验成本，还降低了合成的效率。本研究通过优化反应条件，采用直接产物沉淀法替代色谱纯化，大幅降低了溶剂的使用量和实验的复杂性。实验过程中，研究人员使用了多种溶剂，包括乙醇、甲醇、三氟乙醇（TFE）和水，并通过调整反应浓度和试剂比例，实现了高纯度产物的快速分离。

该方法的另一个关键创新在于利用了两个二级酰胺结构的特性，使产物能够通过分子间氢键作用形成沉淀，从而在反应液中直接析出。这一特性不仅简化了纯化步骤，还提高了合成的效率。此外，为了提高反应的可重复性和可扩展性，研究团队还开发了一种定制的铝制过滤板，并改进了移液器的结构，以确保产物能够高效地转移和过滤。通过这些优化，整个合成过程可以在不到一天的时间内完成四个96孔板的反应，极大地提高了实验的通量。

在产物纯度方面，研究团队采用了一种高通量的分析方法——核磁共振（NMR）技术。通过对每个产物进行单独的NMR分析，研究人员能够在短时间内获得化合物的结构信息，并据此判断其纯度是否符合要求。实验结果显示，有1235种产物的纯度超过了80%，其中大部分被保留用于后续的筛选实验，而其余未达到纯度标准的产物则被排除。这种高纯度的筛选库不仅保证了实验数据的准确性，也为后续的生物活性测试提供了可靠的化合物来源。

为了进一步评估化合物的长期稳定性，研究团队还采用了两种互补的分析技术：声波喷射质谱（AEMS）和超高效液相色谱-紫外-质谱联用（UPLC-MS-UV）。这两种方法分别用于快速检测和详细分析。其中，AEMS技术能够在短时间内完成对整个库的全面检测，其检测速度远高于传统的色谱方法。而UPLC-MS-UV则能够提供更精确的色谱保留时间、紫外吸收数据和质谱信息，为化合物的身份确认和稳定性分析提供了更多维度的数据支持。

通过这些分析方法的结合，研究人员不仅验证了合成库的质量，还揭示了不同化合物在长期储存条件下的稳定性差异。实验结果表明，经过两年的储存，仍有88%的化合物保持稳定并可被检测到，这说明该方法在合成和储存过程中具有较高的耐久性。此外，通过机器学习分析，研究团队还探索了化合物的分子特征（如极性、氢键供体数量等）与沉淀效果之间的关系，为未来的化合物设计提供了理论依据。

本研究的成果具有重要的实际意义。首先，它提供了一种可持续的、可扩展的高通量合成方法，能够在不依赖色谱纯化的情况下，快速生成高质量的共价化合物库。其次，该方法适用于多种实验室设备，操作简便，适合在学术研究机构和制药公司中推广使用。最后，通过结合多种分析技术，研究团队构建了一个全面的从合成到分析的流程，为药物筛选提供了更加系统和高效的工具。

这项研究的意义不仅限于合成技术的创新，还在于其对药物研发流程的优化。传统的药物筛选流程通常需要大量的资源投入，尤其是在合成和纯化环节。而本研究提出的方法通过减少溶剂使用和色谱纯化步骤，显著降低了实验成本，同时提高了合成的效率和可持续性。此外，该方法还为共价药物研发提供了一个完整的平台，使研究人员能够在短时间内获得大量高纯度、可储存的化合物，并进行系统的生物活性测试。

在未来的应用中，这项技术有望被广泛用于学术研究机构的化合物筛选项目，以及制药公司对新型共价抑制剂的开发。特别是在 PROTAC（蛋白降解靶向嵌合体）药物设计和早期药物发现阶段，这种高效的合成与分析流程能够显著提升研究效率，加快药物研发的进程。此外，该方法还可以进一步扩展到其他类型的电亲基团，从而推动更加绿色和可持续的药物筛选策略。

本研究的成果也对药物研发的环保理念提出了新的方向。随着全球对绿色化学的关注不断增加，减少溶剂使用、提高资源利用率已成为制药行业的重要目标。本研究通过采用沉淀法替代色谱纯化，不仅降低了实验的环境影响，还为未来的药物筛选库设计提供了可持续的范例。研究团队还提出了进一步优化的方向，例如使用更环保的溶剂替代三氟乙醇，以及引入自动化固相处理技术以减少实验中的损耗。

总之，这项研究为低分子量化合物筛选库的合成与分析提供了一种全新的方法，不仅提升了实验的效率和可持续性，还为共价药物研发提供了重要的工具。通过结合高效的多组分反应和高通量的分析技术，研究人员成功构建了一个高质量、高稳定性的化合物库，为未来的药物发现和开发奠定了坚实的基础。