IIa类组蛋白去乙酰化酶（HDACs）诱导的降解作用可使对奥沙利铂产生抗性的FBXW7突变结直肠癌重新恢复对药物的敏感性

《Molecular Oncology》：Class IIa HDACs forced degradation allows resensitization of oxaliplatin-resistant FBXW7-mutated colorectal cancer

本研究揭示FBXW7介导的HDAC4泛素化降解在结直肠癌对奥沙利铂（OXPT）耐药中起关键作用。通过PROTAC化合物#11靶向降解HDAC4，成功逆转OXPT耐药性，并恢复HDAC4调控的超级增强子表观基因组状态。机制研究表明，GSK3β磷酸化HDAC4激活FBXW7降解通路，而HDAC4缺失导致氧化磷酸化通路激活和促存活基因上调。该发现为设计靶向HDAC4/PROTAC的联合疗法提供了新依据。

　　在肿瘤发生和对传统治疗产生抗性的子克隆形成过程中，表观遗传可塑性和大规模染色质重塑是重要的特征。这一研究发现，催化失活的IIa类组蛋白去乙酰化酶（HDACs）HDAC4、HDAC5、HDAC7和HDAC9能够通过招募染色质重塑复合物来调控特定的染色质区域，这使它们成为肿瘤学中的潜在治疗靶点。在本研究中，研究人员发现，在DNA修复受损的癌细胞中以及在奥沙利铂（OXPT）治疗后，HDAC4会被蛋白酶体降解。基因筛选显示，FBXW7是负责HDAC4降解的E3泛素连接酶。在结直肠癌（CRC）患者中，FBXW7的功能缺失（LOF）突变较为常见，并且与对OXPT的耐药性发展相关。通过使用基于PROTAC的化合物强制降解IIa类HDACs，可以恢复FBXW7突变CRC细胞、患者来源类器官（PDOs）以及小鼠中的OXPT敏感性。从机制上看，OXPT治疗后去除HDAC4，使染色质状态恢复到类似OXPT敏感细胞的状态。此外，基于HDAC4调控的超级增强子（SEs）表观遗传状态的患者分型，成功识别了对铂类药物耐药的CRC患者。这表明HDAC4是FBXW7突变CRC中OXPT耐药性的关键介质，并强调了超级增强子谱系重塑在OXPT再敏感化过程中的作用。

OXPT为基础的化疗以及含OXPT的化疗方案被推荐用于III期CRC的辅助治疗和转移性CRC的一线治疗。对OXPT的耐药机制包括有限的药物摄取、增加的药物外排或解毒、增强的DNA修复以及凋亡级联反应的激活。由于缺乏明确的遗传联系，表明OXPT耐药性可能由表观遗传机制介导。非选择性的HDAC抑制剂已被证明在恢复耐药CRC细胞对OXPT的敏感性方面有效，这表明组蛋白去乙酰化酶可能在介导铂类药物敏感性中发挥重要作用。

IIa类HDACs作为催化失活的乙酰-赖氨酸阅读器，通过招募染色质重塑蛋白复合物监督组蛋白的乙酰化状态。最近的研究表明，这些去乙酰化酶在调节称为超级增强子（SEs）的增强子簇中具有特定功能，控制主转录因子激活的转录电路。在CRC中，染色质可及性的复发性改变已被报道，并且能够区分恶性与良性病变。尽管有这些重要证据，对化疗耐药CRC子克隆的表观组调控仍知之甚少。

本研究确定了FBXW7作为OXPT处理后HDAC4降解的E3连接酶。通过生物信息学筛选，研究人员评估了HDAC4蛋白水平与365种E3连接酶之间的反相关性，结果发现14种E3连接酶与HDAC4和HDAC5（在这些样本中最丰富的IIa类HDACs）呈负相关。进一步筛选后，研究人员选择了四种E3连接酶（FBXW7、MARCH5、MARCH6、RNF185），其沉默后HDAC4在OXPT处理后积累。在这些条件下，FBXW7的沉默导致HDAC4的稳定化。相比之下，RNF185的沉默仅对HDAC4有轻微影响，而MARCH5和MARCH6的缺失导致HDAC4的高分子量形式积累，这将在未来的研究中进一步探讨。总体而言，这些筛选结果表明FBXW7是HRR阻断条件下HDAC4泛素化和降解的主要E3连接酶。

FBXW7作为SCF（SKP1-CUL1-F-box）E3连接酶，被报道可以控制GSK3β依赖的已知原癌基因的降解。本研究进一步探讨了FBXW7在OXPT处理细胞中调控HDAC4泛素化的作用。研究人员将293细胞与HDAC4-FLAG或MYC-FLAG和GFP或GFP-FBXW7共转染，并在OXPT处理后使用蛋白酶体抑制剂PS-341进行处理。GFP-FBXW7成功与HDAC4-FLAG和MYC-FLAG共纯化，且在OXPT处理后，这种相互作用增强。通过基因敲除，研究人员生成了FBXW7缺失的HCT-116细胞，并验证了其KO状态。使用商业抗体验证了FBXW7的缺失，发现两种抗体在免疫印迹中显示了WT细胞裂解物中不存在的条带。进一步分析表明，FBXW7缺失的HCT-116细胞中，HDAC4蛋白水平在OXPT处理后显著增加，而OXPT对WT细胞的HDAC4蛋白水平则显著降低。PS-341的处理完全恢复了WT细胞中HDAC4的蛋白水平，这表明GSK3β在OXPT处理条件下对HDAC4的泛素化和降解至关重要。

HDAC4的表达在CRC中增加。FBXW7的表达或突变在CRC患者中较为常见，并且与OXPT耐药性相关。通过免疫组织化学（IHC）分析，研究人员在15例II/III级结直肠腺癌活检样本和15例正常邻近组织中检测了HDAC4的蛋白水平，发现癌组织中HDAC4的阳性率显著高于正常组织。在正常组织中，HDAC4仅在小肠隐窝的干细胞巢和杯状细胞中表达，而在CRC中，HDAC4的表达主要表现为全细胞表达，只有少数样本显示出核定位。OXPT处理后，FBXW7野生型细胞中HDAC4的核和细胞质信号显著降低，而FBXW7缺失的细胞中则没有明显变化。这些结果表明，HDAC4的表达水平在CRC中增加，并且其表观遗传调控可能成为治疗靶点。

为了验证HDAC4在OXPT处理后是否能够恢复敏感性，研究人员使用esiRNA或shRNA暂时或稳定沉默了FBXW7缺失的HCT-116细胞中的HDAC4。结果表明，HDAC4的沉默显著增强了OXPT处理细胞中细胞凋亡的激活，且在FBXW7缺失细胞中，这种恢复敏感性效果接近野生型细胞。此外，HDAC4的沉默几乎完全抑制了OXPT耐药性克隆的形成。值得注意的是，HDAC4的沉默不仅在FBXW7缺失细胞中导致OXPT耐药性克隆的形成减少，而且在野生型细胞中也导致细胞增殖和克隆形成能力的下降，这与之前的研究结果一致。

为了进一步验证HDAC4的降解是否能够恢复OXPT的敏感性，研究人员使用了基于PROTAC的化合物#11，该化合物可以特异性地降解HDAC4。结果显示，#11在FBXW7缺失的HCT-116细胞中有效降解了HDAC4，并且在OXPT处理后，其降解水平得到恢复。此外，#11不仅对IIa类HDACs的降解有效，而且对I类和IIb类HDACs的活性没有显著影响。这表明，通过靶向降解HDAC4，可以恢复OXPT的敏感性。此外，#11在FBXW7缺失的细胞中能够显著诱导细胞凋亡，其效果与OXPT单独处理的细胞相当。这一结果支持了通过强制降解HDAC4来恢复OXPT敏感性的治疗策略。

在临床相关性方面，研究人员使用基于HDAC4调控的超级增强子（SEs）表观遗传状态的患者分型，成功识别了对铂类药物耐药的CRC患者。通过分析患者的基因表达数据，研究人员发现，对OXPT敏感的患者中，与HDAC4调控的SEs相关的基因表达模式与对OXPT耐药的患者显著不同。这些结果表明，HDAC4的表达水平和其调控的SEs状态可能是预测OXPT敏感性的重要指标。

最后，研究人员通过体内实验进一步验证了这些发现。在裸鼠模型中，研究人员将FBXW7缺失的HCT-116细胞接种到小鼠体内，并在OXPT处理后使用#11进行治疗。结果表明，#11能够显著减少肿瘤体积和重量，并且在OXPT处理后，其联合使用能够恢复肿瘤细胞对OXPT的敏感性。这些结果支持了HDAC4在OXPT耐药性中的关键作用，并表明通过强制降解HDAC4可以恢复OXPT的治疗效果。此外，通过染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）分析，研究人员发现，HDAC4的调控主要发生在SEs区域，并且这些区域的表观遗传状态在OXPT处理后被重置，从而恢复了对OXPT的敏感性。这些结果表明，HDAC4的表达和其调控的SEs状态在OXPT耐药性中起着重要作用，并且通过靶向降解HDAC4可以恢复对OXPT的敏感性。