一种集成DNA纯化和环介导等温扩增技术的芯片实验室系统，用于定量有毒硅藻Pseudo-nitzschia multistriata

《Sensors & Diagnostics》：A lab-on-a-chip system integrating DNA purification and loop-mediated isothermal amplification for the quantification of the toxic diatom Pseudo-nitzschia multistriata

DNA提取与环介导等温扩增结合的微流控芯片系统开发及在有毒藻类检测中的应用。该系统通过DMA化学和硅胶珠实现高效DNA纯化，成本降低97%，并采用五个月稳定保存的LAMP试剂，在1小时内完成从样本到结果的检测，灵敏度达10 cells/mL。

　　本研究介绍了一种创新的微流控技术，旨在提升对有毒藻类——*Pseudo-nitzschia*（假小环藻）的检测效率。该技术通过将传统实验室中复杂的仪器操作和繁琐的实验流程整合到微型芯片上，实现了一种快速、经济且可靠的检测方法。这项技术的核心在于利用微流控芯片上的“DMA-基DNA提取与浓缩方法”结合“等温扩增技术LAMP”，从而能够对海洋环境中可能产生神经毒素的*Pseudo-nitzschia*进行高效检测。*Pseudo-nitzschia*的细胞释放出的毒素——二甲基氨基甲酸（domoic acid）会对海洋生态系统和人类健康构成严重威胁，因此，及时准确的检测至关重要。

传统的*Pseudo-nitzschia*检测依赖于显微镜观察细胞形态，这种方法虽然能够识别细胞，但在区分有毒和无毒变种方面存在局限性，因为一些有毒和无毒的细胞在形态上可能相似。相比之下，基于核酸扩增的方法，如聚合酶链式反应（PCR）和LAMP，具有更高的灵敏度和特异性。这些方法能够检测特定的基因序列，如与二甲基氨基甲酸合成相关的*dabD*基因，从而更准确地评估潜在风险。然而，PCR和LAMP通常需要集中实验室进行操作，这不仅增加了检测成本，还延长了结果的获取时间，可能对公共健康和经济造成不利影响。

本研究开发的“LAMPTRON”系统，通过整合DNA提取、扩增和检测的多个步骤，提供了一种可现场操作的微型检测平台。该系统利用了DMA（二甲基脂肪亚胺）化学方法进行DNA提取，这种方法基于硅胶珠表面的胺基化处理，能够在无溶剂的条件下捕获DNA，同时避免了传统方法中使用有机溶剂可能对后续反应产生的干扰。DMA能够通过静电相互作用和共价键结合捕获DNA，其结合过程依赖于pH值的变化。当pH值提高到约8时，DNA可以有效地结合到硅胶珠上；而当pH值进一步升至10以上时，DNA可以被释放出来，用于后续的LAMP扩增。

在LAMPTRON系统中，提取和扩增过程都集成在同一个芯片上，大大简化了操作流程。系统包括两个主要模块：DNA提取模块和LAMP检测模块。DNA提取模块使用微流控芯片和硅胶珠进行样本处理，通过控制pH值实现DNA的高效捕获和纯化。而LAMP检测模块则能够实时监测扩增过程，并在无需冷藏的情况下，利用干燥保存的试剂进行检测，从而延长试剂的使用寿命至五个月。这一技术不仅降低了试剂成本，还提高了检测的便利性和可持续性。

实验过程中，研究团队对DMA提取方法进行了优化，以确保DNA的高回收率和纯度。通过调整细胞与DMA裂解液的比例、优化洗涤缓冲液的种类以及控制DNA释放时间，最终实现了高达61.73 ± 0.98 ng μL?1的DNA捕获能力。这表明LAMPTRON在DNA提取方面具有显著的优势，能够满足高灵敏度检测的需求。此外，研究还评估了不同处理方式对DNA纯度和回收率的影响，发现使用硅胶珠相比传统的玻璃纤维膜，能够实现更高的DNA回收效率。

LAMPTRON系统在检测灵敏度方面表现优异，能够检测到每毫升10个细胞的低浓度样本。这种灵敏度对于早期预警和实时监测具有重要意义，尤其是在远离实验室的环境中，如海洋环境或偏远地区，LAMPTRON能够快速提供结果，从而减少对公共健康的潜在威胁。研究还表明，使用干燥保存的LAMP试剂与新鲜试剂在检测性能上没有显著差异，这为现场检测提供了更大的灵活性。

在实验设计方面，LAMPTRON系统采用了自动化操作流程，包括微流体控制和温度调节。微流体阀门用于精确控制液体流动，而Peltier加热器则确保LAMP扩增反应在恒定温度下进行。为了提高检测的准确性，研究团队还设计了独立的荧光检测模块，能够实时监测DNA扩增过程中的荧光信号变化。通过多次实验和数据分析，LAMPTRON系统展示了其在不同细胞浓度下的稳定性和重复性，特别是在处理低浓度样本时，仍然能够保持较高的检测灵敏度。

本研究还探讨了LAMPTRON系统在实际应用中的潜力。由于其操作简便、成本低廉且无需复杂的设备，LAMPTRON非常适合用于环境监测和生物危害诊断。此外，研究团队提出了进一步改进的方向，例如开发便携式、电池供电的版本，以实现完全自主的现场检测。通过增加芯片的容量或使用更小的硅胶珠，可以提高DNA的捕获效率。然而，这种改进也伴随着技术挑战，例如防止微小颗粒在微流控系统中迁移，从而避免对后续扩增步骤造成干扰。

研究结果表明，LAMPTRON系统在多个方面都优于传统方法。它不仅减少了样本运输和实验室处理的时间，还降低了试剂成本，同时保持了检测的准确性和可靠性。这种系统对于实时监测有毒藻类的爆发具有重要意义，能够帮助相关部门及时采取措施，防止毒素对环境和人类健康的危害。此外，LAMPTRON的可重复性和稳定性也为其在大规模环境监测中的应用提供了支持。

本研究还强调了环境监测的重要性。随着全球气候变化，有害藻类的爆发频率和强度正在增加，这对海洋生态系统和人类健康构成了更大的挑战。传统的检测方法往往滞后，而LAMPTRON的快速响应能力使其成为一种理想的解决方案。通过在芯片上实现完整的检测流程，LAMPTRON不仅提高了检测效率，还降低了对专业实验室的依赖，使得现场检测成为可能。

在实际应用中，LAMPTRON系统可以用于监测海洋环境中的有害藻类，特别是在沿海地区和水体中。其检测结果可以为渔业、水产养殖和休闲渔业提供重要的参考信息，帮助相关部门评估风险并采取相应的措施。此外，该系统还可用于评估海洋生物毒素的分布情况，为生态研究和环境政策制定提供数据支持。

总之，LAMPTRON系统代表了一种创新的微流控技术，它通过整合DNA提取和LAMP扩增，实现了快速、高效、低成本的环境监测。该系统不仅提高了检测的灵敏度和特异性，还减少了对实验室设备的依赖，使得现场检测成为现实。随着技术的不断进步，LAMPTRON有望在未来的环境监测和生物危害诊断中发挥更大的作用，为全球海洋健康和食品安全提供更可靠的保障。