综述：诱导多能干细胞重编程进展及其在肌萎缩侧索硬化中的应用：一篇综述

《FASEB BioAdvances》：Advances in Induced Pluripotent Stem Cell Reprogramming and Its Application in Amyotrophic Lateral Sclerosis: A Review

本综述系统梳理了iPSC（诱导多金能干细胞）重编程技术的重大进展，包括重编程因子（如OSKM组合）的优化、递送系统（从整合性病毒载体到非整合性非病毒载体）的革新、体细胞选择范围的扩大以及化学重编程（完全使用小分子诱导）的出现。文章重点探讨了iPSC来源的运动神经元（iPSC-MN）模型在模拟ALS（肌萎缩侧索硬化）病理、揭示分子机制（如TDP-43蛋白异常定位）及加速药物（如Retigabine、Bosutinib）筛选方面的变革性应用，展望了iPSC技术在疾病建模和再生医学中的广阔前景。

　　

ABSTRACT

自山中伸弥通过使用四个关键转录因子——OCT4、SOX2、KLF4和c-Myc（OSKM）将体细胞重编程为诱导多能干细胞（iPSC）的里程碑式成就以来，iPSC技术已取得显著进展。显著进步包括改进重编程因子、递送系统、体细胞选择、重编程条件的优化，以及化学重编程方法的发展。凭借其无与伦比的增殖能力和近乎多能的分化潜能，iPSC已成为研究神经退行性疾病（包括肌萎缩侧索硬化（ALS））的宝贵工具。源自ALS患者特异性iPSC的神经元模型，特别是iPSC来源的运动神经元（iPSC-MN），为重现疾病特异性病理和研究ALS的分子机制提供了一个强大的平台，从而加速了新治疗策略的发现。

iPSC重编程

重编程因子

识别和优化重编程因子是推进iPSC技术的关键。研究表明，OSKM组合中的c-Myc作为一个癌基因，其过表达有助于肿瘤发生，这对iPSC的稳定性和安全性构成显著风险。研究发现，仅表达OCT4、SOX2和KLF4三个转录因子即可实现体细胞重编程，表明c-Myc并非必需。后续发现用L-Myc替代c-Myc可降低iPSC的致瘤风险，同时保持重编程效率。Thomson JA团队证明OCT4、SOX2、NANOG和LIN28（OSNL）足以重编程人类体细胞为多能干细胞。进一步研究表明，KLF2和KLF5可替代KLF4，SOX1和SOX3可替代SOX2，L-Myc和N-Myc可替代c-Myc。此外，非重编程因子家族的基因或小分子（如NR5A2可替代OCT4，小分子RepSox可替代SOX2，Esrrb和Glis1可作为c-Myc的替代品）也显示出类似效果。为提高效率，研究发现SALL4、p53抑制、特定miRNA（如miR-302/367, miR-372, Lin28）以及染色质重塑基因（如SUV39H1, YY1, DOT1L）和表观遗传调节剂（如5-氮杂胞苷、丙戊酸VPA）可显著增强重编程。

重编程的递送系统

递送系统对iPSC的安全性和效率至关重要。下表总结了不同载体/平台类型的特性：

表1：不同重编程方法的比较

早期iPSC生成依赖于逆转录病毒和慢病毒等整合性病毒载体，效率高但存在基因组整合风险，可能导致遗传突变和肿瘤发生。非整合性病毒载体，如腺病毒（基因组不整合，但效率极低）和仙台病毒（SeV，胞质RNA病毒，无整合风险，效率高），提供了更安全的选择。PiggyBac转座子可实现位点特异性整合，并可通过转座酶表达实现精确切除，获得无足迹iPSC，但存在再激活和脱靶整合风险。非整合性非病毒载体包括mRNA（通过合成修饰的mRNA编码重编程因子，无整合风险，效率高但mRNA不稳定需频繁转染）和附加体载体（如基于oriP/EBNA1的载体，不整合基因组，随细胞增殖逐渐丢失，安全性高）。化学重编程则完全使用小分子组合，无需外源基因表达，安全性更高。

用于重编程的体细胞选择

多种体细胞类型已被成功重编程为iPSC，包括成纤维细胞、尿液细胞、角质形成细胞、肝细胞等。随着技术进步，外周血来源的单核细胞（如T细胞、B细胞、CD34+造血干细胞）因其易获取、侵入性小，已成为重编程的理想选择。iPSC来源的T细胞在肿瘤治疗（如CAR-T）方面具有潜力。

重编程条件的优化

iPSC技术的快速发展与培养条件的持续优化密切相关。早期培养系统使用血清成分和小鼠饲养层细胞，存在标准化难题和外源污染风险。发展至今，已出现多种明确成分、无血清的培养液（如mTeSR1, mTeSR Plus, TeSR-E8等）与细胞外基质（如Matrigel, Vitronectin XF）联用，支持iPSC的维持和增殖，提高了iPSC生成的质量、稳定性并降低了异种污染风险。

化学重编程生成iPSC

邓宏魁团队开发了iPSC化学重编程的里程碑技术，仅使用小分子组合替代传统外源因子重集体细胞为iPSC。该过程是分阶段的，通过特定小分子组合将人类细胞诱导为上皮样细胞，进而通过去甲基化等处理使其进入高增殖能力和可塑性的中间状态，最终诱导为人类多能干细胞。这种方法提供了更精简、适应性更强且更安全的替代方案。

供体来源iPSC的基因组安全性：从生物样本库到临床转化

供者体细胞来源的iPSC携带供者的完整核基因组。这些遗传变异在重编程过程中被保留，成为iPSC细胞系的固有遗传背景。表观遗传记忆导致iPSC倾向于向其原始组织谱系分化。关于重编程和培养过程中是否引入新变异存在不同观点。同种异体iPSC的应用策略主要包括通过HLA匹配建立“超级供体”干细胞库，或通过基因编辑实现HLA伪装（如敲除B2M或引入HLA-E/B2M嵌合分子），以降低免疫排斥风险。在iPSC库的质量控制中，全基因组测序（WGS）正逐渐取代全外显子组测序（WES），以更全面地评估遗传缺陷。

iPSC在ALS中的应用

iPSC推动神经退行性疾病研究

与小鼠模型相比，iPSC来源的模型（如iPSC-MN、iPSC来源的皮质神经元模型、脑类器官）在神经退行性疾病研究中日益受到关注。这些模型主要通过两种途径构建：一是生成患者特异性iPSC并分化为相关神经元类型；二是利用基因编辑技术（如CRISPR/Cas9）在iPSC中引入致病突变。iPSC技术与基因编辑的结合显著推进了基于iPSC的人类疾病模型研究。

iPSC-MN在ALS中的应用

ALS的特征是上下运动神经元的进行性退化。iPSC来源的运动神经元（iPSC-MN）模型能有效复现ALS相关的病理特征，如神经丝断裂、缠结、持续性神经元死亡，以及TDP-43的异常胞质定位和蛋白聚集物形成。目前，多种小分子组合已被开发用于将iPSC定向分化为运动神经元，主要依赖于双SMAD抑制（抑制BMP和TGF-β信号通路）模拟胚胎发育中的神经外胚层形成。持续激活WNT信号通路结合双SMAD抑制可更有效地驱动iPSC分化为神经上皮祖细胞和神经祖细胞。随后，视黄酸（RA）和SHH激动剂（如Purmorphamine, SAG）促进其分化为运动神经元。Notch信号抑制剂的加入支持功能性成熟运动神经元的生成。在ALS患者来源的运动神经元中添加神经营养因子（如BDNF, GDNF）有助于减轻神经元死亡。

利用iPSC-MN模型，研究者已识别出ALS的潜在治疗药物，如Retigabine（KCNQ2/3电压门控钾通道开放剂，可缓解谷氨酸兴奋性毒性并抑制运动神经元超兴奋性）、Bosutinib（酪氨酸激酶抑制剂，促进错误折叠SOD1毒性蛋白的自噬清除）和Ropinirole（多巴胺D2受体激动剂，可改善FUS和TDP-43的错误定位、应激颗粒异常聚集等）。这些发现凸显了iPSC-MN在研究ALS发病机制和筛选潜在治疗药物方面的有效性。

尽管iPSC-MN模型取得了显著进展，但仍面临挑战，例如模型主要侧重于下运动神经元，对上运动神经元的代表性存在疑问。获得单细胞运动神经元以及开发更高效的分化方案也是关键技术难点。

讨论

患者来源iPSC模型的使用仍存在一些局限性。大约95%的ALS病例是散发性的，病因涉及遗传和环境因素之间的复杂相互作用。自体iPSC虽然能保留患者表观遗传景观，但存在分化方案耗时长、成本高、时间投入大等问题。同种异体iPSC则缺乏患者特异性表观基因组印记。临床应用前需对供体来源iPSC系进行WGS评估。iPSC技术正处于从基础研究向临床应用过渡的关键阶段。建立严格的质量标准、监管框架和全面指南至关重要。化学重编程等新技术可能有助于克服当前的一些局限性。

自创立以来，iPSC技术经历了显著发展。重编程方法和培养条件的持续优化显著提高了其效率、安全性和稳定性，使其在基础研究和临床应用中具有不可估量的价值。iPSC来源的模型在推进复杂神经退行性疾病的疾病建模和揭示致病机制方面发挥了变革性作用。尽管取得了显著进展，但iPSC技术在临床转化和大规模应用方面仍面临相当多的挑战，特别是在衍生细胞产品的质量、稳定性和安全性方面。克服剩余的挑战将为更广泛的临床应用打开大门，使iPSC技术成为疾病研究和治疗中的变革性工具。