宿主细胞DNA和染色质对非对称流场流动分级中利用光散射技术分析类病毒颗粒的影响

《Journal of Separation Science》：Impact of Host Cell DNA and Chromatin on Virus-like Particle Analysis by Light Scattering in Asymmetrical Flow Field-flow Fractionation

本研究探讨了宿主细胞DNA和染色质对AF4-MALS-DLS分析HIV-1 gag VLP的影响。发现DNA和染色质与VLP共流出，导致浓度和尺寸测定偏差，但LS90°峰面积与NTA粒子浓度线性相关（R2=0.997），可用于快速替代NTA。结论是需要优化AF4方法以分离杂质并确保可靠表征。

　　病毒样颗粒（VLP）是生物治疗领域的重要组成部分，尤其在治疗性疫苗和药物递送系统中有着广泛的应用。随着VLP生产技术的不断进步，对VLP的分析和表征变得越来越关键。然而，VLP的生产过程中常常伴随着宿主细胞来源的杂质，如宿主细胞DNA和染色质，这些杂质可能会影响VLP的定量和表征结果，从而对产品质量和工艺优化产生不利影响。因此，研究如何准确分离和分析这些杂质对于确保VLP的质量和产量具有重要意义。

本文探讨了使用非对称流场流分级（AF4）结合在线检测器，如紫外（UV）和多角度光散射（MALS）技术，来评估VLP样本的量和质量的可行性。AF4是一种基于粒子大小和扩散性质的分离技术，其原理是通过一个半渗透膜，使粒子在流体流动过程中根据其大小被分离。在AF4系统中，较小的粒子会因扩散力更强而更快地被洗脱，而较大的粒子则因受到膜的阻力而较慢地洗脱。这种大小依赖的洗脱行为使得AF4成为一种有效的工具，可用于分析复杂的生物纳米颗粒混合物。

尽管AF4-MALS技术在VLP的分析中表现出良好的潜力，但研究发现，宿主细胞来源的杂质可能会与VLP共洗脱，从而导致VLP浓度的高估和产量计算的不准确。这主要是因为这些杂质与VLP在尺寸分布上存在重叠，使得它们难以通过简单的分离方法区分。例如，在未纯化的VLP样本中，DNA和染色质的洗脱峰与VLP的洗脱峰重叠，这可能影响到对VLP数量的准确判断。因此，优化AF4方法，提高VLP与杂质的分离能力，是确保VLP质量表征准确性的关键。

此外，本文还探讨了AF4-MALS与纳米颗粒追踪分析（NTA）在VLP总粒子数测定上的相关性。研究发现，AF4-MALS中的90°光散射峰面积与NTA测定的总粒子浓度之间存在线性关系，这表明AF4-MALS可以作为NTA的替代方法，从而加快样品处理过程并减少样品体积的需求。这种替代方法不仅提高了效率，还降低了对操作人员的依赖，使实时或近实时过程分析成为可能。

在分析纯化后的VLP样本时，研究发现，AF4-MALS能够提供关于粒子尺寸分布和结构的重要信息，包括流体力学半径（R_hyd）和回转半径（R_g）。这些参数对于评估VLP的结构完整性和质量特征至关重要。然而，研究也指出，检测器的流速对R_hyd的测量有显著影响。在较高的流速下，R_hyd的测量值可能被低估，这可能导致形状因子的异常升高。形状因子通常用于估计粒子的形态，如球形、椭圆形或棒状等。因此，选择合适的检测器流速对于获得准确的R_hyd和形状因子至关重要。

研究还指出，AF4-MALS-DLS方法能够提供关于粒子形状的额外信息，这在VLP的质量评估中非常有用。然而，由于粒子种类多样，且尺寸分布重叠，单独依赖AF4-MALS可能不足以准确表征所有粒子的特性。因此，需要结合其他分析方法，如Western blot和PicoGreen检测，以更全面地评估样品中的杂质和VLP含量。

综上所述，AF4-MALS-DLS作为一种无标记的快速分析方法，在VLP的表征和定量中展现出良好的应用前景。然而，为了提高其准确性，需要进一步优化分离条件，特别是检测器流速和膜的选择，以更好地分离VLP和宿主细胞来源的杂质。此外，开发新的预处理技术，如使用盐活化核酸酶去除染色质，也可以提高AF4方法的适用性和准确性。这些研究结果不仅有助于改进VLP的生产过程，也为生物纳米颗粒的分析提供了重要的参考。