靶向HDAC2的黄酮类化合物Galangin 3-methyl ether通过抑制PI3K-AKT通路改善小鼠肥厚型心肌病

《Acta Pharmacologica Sinica》：Galangin 3-methyl ether alleviates mouse hypertrophic cardiomyopathy via targeting HDAC2 and subsequently inactivating the PI3K-AKT signaling pathway

本研究针对病理性心肌肥厚缺乏有效治疗策略的临床难题，聚焦天然黄酮类化合物Galangin 3-methyl ether(G3-ME)的心脏保护作用。研究人员通过Ang II诱导的细胞模型和Myh6R404Q/Tnnt2R109Q转基因小鼠模型，结合RNA测序与网络药理学分析，首次发现G3-ME通过直接靶向组蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)，抑制其Ser394位点磷酸化，进而阻断PI3K-AKT信号通路活化。该研究不仅阐明了G3-ME缓解心肌肥厚的新机制，更为肥厚型心肌病(HCM)的治疗提供了潜在候选药物。

　　

心脏作为人体最重要的泵血器官，拥有强大的代偿能力。当面临运动训练或妊娠等生理需求时，心脏会出现生理性肥厚，这是一种适应性变化，通常不会导致心功能障碍。然而，在高血压、心脏瓣膜病或遗传因素等病理条件下，心脏则会发生病理性肥厚，这种肥厚伴随心肌细胞体积增大、心肌纤维排列紊乱及纤维化，最终可引发心律失常甚至心力衰竭。其中，肥厚型心肌病(Hypertrophic Cardiomyopathy, HCM)是一种常染色体显性遗传性心肌病，主要由编码肌节蛋白的基因突变引起，是青少年猝死的主要原因之一。目前，临床上尚缺乏能够有效逆转心肌肥厚特别是HCM进展的药物，因此，探寻能够抑制心肌肥厚的可行靶点或药物至关重要。

在病理性心肌肥厚的发展过程中，多种信号通路出现异常，其中磷酸肌醇3-激酶-蛋白激酶B(PI3K-AKT)信号通路的持续异常激活尤为关键。同时，心肌细胞中会重新激活“胎儿基因程序”，如心房钠尿肽(NPPA)和脑钠肽(NPPB)的表达升高，这被认为是心肌肥厚的标志。基因表达的转录调控在很大程度上受到组蛋白修饰的影响，特别是组蛋白的乙酰化和去乙酰化修饰，分别由组蛋白乙酰转移酶(HATs)和组蛋白去乙酰化酶(HDACs)催化完成。HDAC家族中的I类HDACs（如HDAC2）被证实能够促进心肌肥厚反应。研究表明，HDAC2主要通过其Ser394位点的磷酸化而被激活，进而激活PI3K-AKT信号通路下游级联反应，最终导致心肌肥厚。因此，靶向抑制HDAC2的活性可能为治疗病理性心肌肥厚提供新策略。

高良姜是一种传统中药材，其根茎提取物具有多种药理活性。Galangin 3-methyl ether(G3-ME)是galangin的结构类似物，由galangin第三个羟基位置甲基化而成。这一修饰降低了G3-ME的极性，增加了其亲脂性，从而更易于进入细胞发挥作用，同时增强了其对抗氧化应激和代谢降解的稳定性。已有研究表明galangin对多种心肌病具有保护作用，但G3-ME在心脏疾病，特别是病理性心肌肥厚中的作用机制尚不清楚。

为此，江南大学基础医学系叶超教授团队在《Acta Pharmacologica Sinica》上发表了一项研究，旨在探究G3-ME对病理性心肌肥厚的影响及其作用机制。研究人员设想，G3-ME可能通过干预HDAC2及其下游信号通路，发挥抑制心肌肥厚的作用。

为开展本研究，作者运用了多项关键技术方法：利用Ang II诱导的大鼠心肌细胞系H9c2和人胚胎干细胞源性心肌细胞(hESC-CMs)建立体外心肌肥厚模型；采用两种遗传性HCM转基因小鼠模型（Myh6^R404Q和Tnnt2^R109Q小鼠）进行在体实验；通过RNA测序(RNA-Seq)结合网络药理学筛选G3-ME的潜在作用靶点；采用药物亲和反应靶点稳定性(DARTS)实验、细胞热位移分析(CETSA)和表面等离子共振(SPR)技术验证G3-ME与HDAC2的直接结合；通过蛋白质印迹(Western blot)、免疫荧光、实时定量PCR(qRT-PCR)等技术检测相关分子表达和细胞表型；利用超声心动图、组织学染色（H&E、Masson、WGA）评估小鼠心脏功能和结构改变。

G3-ME治疗缓解Ang II诱导的心肌细胞肥厚

研究人员首先评估了G3-ME对心肌细胞的安全性，发现其对H9c2细胞的半抑制浓度(IC₅₀)为175.3 μM，表明其毒性较低。在Ang II诱导的H9c2细胞肥厚模型中，G3-ME(2.5-20 μM)以浓度依赖的方式抑制了肥厚标志基因Nppa和Nppb的表达。选择5 μM G3-ME（远低于IC₅₀）处理24小时，能有效逆转Ang II引起的H9c2细胞面积增大以及ANP和BNP蛋白水平的升高。

考虑到啮齿类与人类心肌细胞的差异，研究团队进一步利用人胚胎干细胞(hESCs)定向分化为心肌细胞(hESC-CMs)。同样地，G3-ME对hESC-CMs也显示出低毒性(IC₅₀ ≈ 245.4 μM)。G3-ME处理能显著抑制Ang II诱导的hESC-CMs中NPPA和NPPB的mRNA和蛋白表达升高，减小细胞面积，并缓解细胞内钙离子(Ca²⁺)瞬变活动的异常增强。

G3-ME改善HCM小鼠模型的心脏功能与结构

在体实验中，研究人员选用Myh6^R404Q转基因小鼠（模拟人类MYH7基因R403Q突变所致HCM）进行验证。分别给予20 mg·kg^-1·d^-1（低剂量）和50 mg·kg^-1·d^-1（高剂量）G3-ME灌胃处理4周。结果显示，G3-ME治疗能显著降低Myh6^R404Q小鼠的心脏重量与体积，改善超声心动图参数，包括降低异常增高的左心室质量、室壁厚度和射血分数(EF)，增加左心室容积和直径，并恢复反映心脏舒张功能的E/A峰值比。

进一步的组织学分析表明，G3-ME能减轻Myh6^R404Q小鼠的心肌损伤标志物（Nppa、Nppb）表达和血清NT-proBNP水平，改善心肌纤维排列紊乱，减小心肌细胞横截面积，并抑制心肌纤维化的发展（表现为纤维化面积和Acta2、Col1a1、Col3a1等纤维化标志物表达的降低）。

为验证G3-ME作用的普适性，研究团队在另一种HCM小鼠模型Tnnt2^R109Q（模拟人类TNNT2基因R92Q突变）中进行了验证。给予20 mg·kg^-1·d^-1 G3-ME治疗4周后，同样观察到了心脏功能（超声参数、E/A比、NT-proBNP）和结构（心肌细胞面积、纤维化）的显著改善。

G3-ME通过调控PI3K-AKT信号通路抑制心肌肥厚

为阐明G3-ME的作用机制，研究人员对Ang II处理及G3-ME+Ang II处理的hESC-CMs进行了RNA测序。京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析显示，差异表达基因显著富集于PI3K-AKT信号通路。后续的蛋白水平验证证实，Ang II能激活H9c2细胞、hESC-CMs以及HCM小鼠心脏中的PI3K-AKT通路（表现为PI3K p85和AKT磷酸化水平升高），而G3-ME处理能有效抑制该通路的激活。

G3-ME直接靶向HDAC2并抑制其磷酸化

通过网络药理学分析，研究人员从数据库中筛选出42个G3-ME潜在作用靶点与HCM相关基因的交集，KEGG分析提示这些基因同样富集于PI3K-AKT通路。分子对接结果显示，G3-ME与HDAC2的结合能最高，可与其HIS62、ARG60和TYR19等氨基酸残基形成氢键。

实验验证发现，Ang II和HCM小鼠心脏中HDAC2的磷酸化（Ser394位点）水平升高，而G3-ME能逆转这一现象。DARTS和CETSA实验表明，G3-ME能增强HDAC2的蛋白稳定性，使其不易被蛋白酶降解或热变性。SPR实验进一步直接证实了G3-ME与HDAC2蛋白的结合，亲和力为3.36 μM。机制上，G3-ME通过直接结合HDAC2，干扰了其与Casein Kinase 2α (CK2α)的相互作用，从而抑制了HDAC2的磷酸化激活，但并不影响其与蛋白磷酸酶2CA(PP2CA)的结合。

干扰HDAC2表达影响G3-ME的心脏保护作用

为确认HDAC2是G3-ME发挥作用的关键靶点，研究人员构建了HDAC2稳定敲低(KD)和过表达(OE)的H9c2细胞系。结果显示，敲低HDAC2本身即可抑制肥厚标志基因表达和细胞增大，并且削弱了Ang II的促肥厚作用，同时G3-ME的疗效也基本被抵消。相反，过表达HDAC2则促进了心肌肥厚表型，并减弱了G3-ME对Ang II诱导肥厚的抑制作用。在信号通路层面，HDAC2敲低抑制了PI3K-AKT通路的激活，而过表达则增强了该通路的活动，并影响了G3-ME的调控效果。此外，研究还发现HDAC2通过抑制肌醇多磷酸-5-磷酸酶F(INPP5F)的表达来持续激活AKT信号，而G3-ME可能通过抑制HDAC2来解除对INPP5F的抑制，从而抑制AKT信号。

本研究系统阐明了天然化合物G3-ME在病理性心肌肥厚，包括遗传性HCM中的治疗作用及其分子机制。研究结果表明，G3-ME能够直接靶向HDAC2，通过抑制其Ser394位点的磷酸化（可能通过干扰其与CK2α的相互作用），进而负向调控PI3K-AKT信号通路，最终抑制心肌细胞肥厚、改善心脏功能与结构。该研究不仅首次揭示了G3-ME的心脏保护作用及其靶点HDAC2，为理解病理性心肌肥厚的发病机制提供了新的视角，更重要的是，为开发治疗HCM和病理性心肌肥厚的新型靶向药物提供了有前景的先导化合物。G3-ME作为一种天然来源的化合物，具有较低的细胞毒性和良好的药理特性，未来有望成为临床治疗的新选择。同时，该研究也提示，联合应用G3-ME与HDAC2抑制剂可能为缓解心肌肥厚及相关心力衰竭提供更有力的策略。