基于CRISPR-Cas13a的SHERLOCK技术实现犬腺病毒2型的快速可视化检测

《Journal of Microbiological Methods》：A rapid and visual detection for canine Adenovirus-2 using CRISPR-Cas13a-based SHERLOCK technology

本研究针对犬腺病毒2型（CAdV-2）现有检测方法耗时长、需专业设备等痛点，开发了一种整合HUDSON核酸快速提取、重组酶辅助扩增（RAA）及CRISPR/Cas13a侧切活性的横向流动试纸条检测技术。该方案在90分钟内实现102拷贝/μL的灵敏度，临床样本检测与PCR结果一致性达95%，为兽医现场诊断提供了高效工具。

　　

在犬类传染病防控领域，犬腺病毒2型（Canine Adenovirus type 2, CAdV-2）是引发幼犬传染性气管支气管炎和病毒性肠炎的重要病原体。这种病毒往往与其他病原体协同感染，加剧临床症状，给养殖场和宠物医院带来严峻挑战。然而，传统检测方法如聚合酶链式反应（PCR）虽灵敏度高，却存在明显局限：检测流程耗时较长，需要复杂的核酸纯化步骤，依赖昂贵的仪器设备，且必须由专业技术人员操作。这些限制使得在资源有限的基层兽医站、宠物诊所或野外环境下，难以实现快速准确的病原诊断，从而延误疫情控制的最佳时机。

为突破这一瓶颈，发表在《Journal of Microbiological Methods》上的研究提出了一种创新解决方案。研究人员将CRISPR/Cas13a基因编辑技术与现场快速检测需求相结合，开发出一套集核酸快速提取、等温扩增和可视化读出于一体的检测平台。该技术不仅省去了繁琐的核酸纯化过程，还通过横向流动试纸条实现裸眼判读，大幅降低了对专业设备的依赖，使CAdV-2检测变得像验孕试纸一样简便易行。

本研究主要整合了四项关键技术：HUDSON（Heating Unextracted Diagnostic Samples to Obliterate Nucleases）法实现临床样本中核酸的快速释放；重组酶辅助扩增（Recombinase-Aided Amplification, RAA）完成靶标基因的等温放大；CRISPR/Cas13a系统通过其侧切活性（collateral cleavage）特异性识别并切割病毒RNA；最后通过横向流动试纸条（Lateral Flow Strip）进行可视化结果判读。研究共测试了20份临床样本，以验证方法的实际应用价值。

灵敏度分析

通过梯度稀释的病毒标准品测试显示，该检测体系的最低检测限为10² copies/μL（相当于每个反应约750个拷贝），这一灵敏度与常规分子诊断方法相当，完全满足临床检测需求。

特异性验证

研究人员选取了五种常见犬类病毒（包括犬瘟热病毒、犬细小病毒等）进行交叉反应测试。结果表明，该检测方法仅对CAdV-2产生特异性信号，与其他病原体无任何交叉反应，证明了其高度特异性。

临床样本评估

在20份临床样本的盲测中，新方法与传统单重PCR检测结果的符合率高达95%，仅有一例存在差异。进一步分析发现，该差异样本的病毒载量接近检测下限，提示新方法在低载量样本中仍保持良好可靠性。

操作便捷性评估

整个检测流程可在90分钟内完成，且仅需水浴锅等基础设备，无需复杂仪器。横向流动试纸条的结果判读直观明确，非专业人员经过简单培训即可准确操作。

该研究成功构建了首个针对CAdV-2的CRISPR/Cas13a现场检测平台，突破了传统检测方法的技术壁垒。通过将HUDSON、RAA、CRISPR/Cas13a和横向流动试纸条四项技术有机整合，实现了"样本进-结果出"的一体化检测模式。该方法不仅具备高灵敏度和特异性，更在操作便捷性和检测速度上展现显著优势，特别适合基层兽医单位和现场防控使用。

值得注意的是，研究中采用的CRISPR/Cas13a技术属于新一代基因编辑工具，其侧切活性能够在外导RNA（crRNA）引导下识别特定核酸序列后，非特异性切割周围报告分子，从而产生放大信号。这种"分子开关"特性使其在病原检测中具有独特优势。而重组酶辅助扩增（RAA）作为等温扩增技术，摆脱了对热循环仪的依赖，使整个检测过程可在恒定温度下完成。

这项研究的创新价值不仅在于开发了新的检测方法，更推动了CRISPR诊断技术在兽医传染病领域的应用边界。相比人类医学，动物疫病现场诊断技术发展相对滞后，该研究为其他动物病原的快速检测提供了可借鉴的技术范式。未来通过优化crRNA设计、开发多靶标检测试纸条，有望进一步拓展该方法的应用范围，实现多种病原的同时检测。

从更广阔的视角看，这项研究体现了现代分子诊断技术向现场化、可视化、简易化发展的趋势。随着CRISPR技术的不断成熟，类似"基因试纸条"的检测产品将在人畜共患病防控、食品安全监测、边境检疫等领域发挥越来越重要的作用。该研究为CRISPR诊断技术从实验室走向现场应用提供了重要案例，也为应对未来可能出现的动物疫情提供了技术储备。