选择性PDE4B/PDE4D双功能降解剂的发现及其在慢性炎症性疾病治疗中的潜力

《Journal of Translational Autoimmunity》：Discovery of a PDE4B and PDE4D selective bifunctional degrader for management of chronic inflammatory disorders

本研究针对传统PDE4抑制剂在特应性皮炎等慢性炎症性疾病治疗中存在的选择性差、中枢神经系统副作用等问题，开发了新型PDE4B/PDE4D选择性双功能降解剂。研究证实降解剂BTX-AP04能通过CRBN介导的泛素-蛋白酶体途径特异性降解PDE4B/D，在体外实验中其抑制炎性细胞因子释放的效力比传统抑制剂高1000倍，并在小鼠模型中展现出良好的药代动力学特征和治疗效果，为炎症性皮肤疾病提供了更安全有效的治疗新策略。

　　

在慢性炎症性疾病治疗领域，磷酸二酯酶4（PDE4）一直是一个备受关注的治疗靶点。作为特异性水解环磷酸腺苷（cAMP）的关键酶，PDE4在免疫细胞中高度表达，通过调控cAMP水平影响炎症反应进程。目前临床使用的PDE4抑制剂，如阿普斯特（Apremilast）和罗氟司特（Roflumilast），虽然能够有效缓解炎症症状，但普遍存在中枢神经系统副作用（如恶心、呕吐等）和选择性不足的问题，这严重限制了其长期临床应用。

特应性皮炎（AD）作为一种常见的慢性炎症性皮肤疾病，全球有超过1500万患者受其困扰。该疾病的发病机制涉及辅助性T细胞2（T_H2）和17（T_H17）等多种免疫细胞的异常活化，导致促炎细胞因子大量释放，皮肤屏障功能受损。尽管现有治疗方法包括局部抗炎药物、生物制剂等，但大多存在疗效有限或安全性问题。因此，开发具有更高选择性和安全性的PDE4靶向治疗策略成为当务之急。

近年来，靶向蛋白降解技术（TPD）的兴起为药物研发带来了新的思路。特别是蛋白降解靶向嵌合体（PROTAC）等双功能降解剂，能够利用细胞内天然的泛素-蛋白酶体系统特异性降解靶蛋白，不仅克服了传统抑制剂"占据驱动"模式的局限性，还展现出催化性、长效性等独特优势。基于这一背景，Biotheryx公司的研究团队开展了一项创新性研究，致力于开发选择性PDE4B和PDE4D亚型的双功能降解剂，相关成果发表在《Journal of Translational Autoimmunity》上。

研究团队采用了一系列关键技术方法开展此项工作。他们通过分子对接和分子力学优化，设计了以Apremilast为靶标结合配体、以CRBN E3连接酶配体为降解元的新型双功能降解剂。利用蛋白质免疫印迹（Western blot）技术系统评估了降解剂对PDE4各亚型的降解效率，并通过HiBiT荧光素酶报告基因实验分析了降解剂对CRBN已知新底物的选择性。研究还采用电化学发光免疫分析（MSD）和FRET（荧光共振能量转移）技术检测细胞内cAMP水平变化，并在oxazolone诱导的小鼠特应性皮炎模型和人工外周血单核细胞（PBMC）诱导的移植物抗宿主病（GvHD）模型中评估了降解剂的体内药效学特征。

3.1. 在人源细胞中实现PDE4的强效选择性降解

研究人员首先在人工外周血单核细胞（PBMC）中验证了先导降解剂BTX-AP04对PDE4四个亚家族（A-D）的降解效果。结果显示，BTX-AP04能够快速、剂量依赖性地降解PDE4B和PDE4D，最大降解率可达86%，而对PDE4A和PDE4C的降解效率低于40%。特别值得注意的是，降解剂在4小时即可观察到明显的降解效果，展现了快速起效的特点。

为了建立更优化的体外评价模型，团队筛选了9种人源癌细胞系，发现A549细胞中PDE4D（长短异构体）的表达水平显著高于其他细胞系。进一步实验证实，BTX-AP04在A549细胞中能够有效降解PDE4B和PDE4D，对短异构体的最大降解率可达95%。通过分子模拟分析，研究人员发现降解剂与CRBN和PDE4D之间形成多重相互作用，包括连接区-NH与CRBN的Ser227和Asp272之间的氢键，这为降解剂的高效性提供了结构基础。

3.2. PDE4降解剂实现更显著的cAMP积累且降解活性依赖CRBN

cAMP作为重要的第二信使，其水平升高是PDE4抑制剂发挥抗炎作用的关键机制。研究团队比较了传统PDE4抑制剂与降解剂BTX-AP03对PBMC中cAMP积累的影响。结果显示，BTX-AP03能够诱导剂量依赖性的cAMP积累，其效力比传统抑制剂强2倍以上。通过FRET技术使用EPAC-S^H187 cAMP传感器进一步验证了这一结果。

为了确认降解活性的CRBN依赖性，研究人员合成了N-甲基化版本的BTX-AP04（BTX-AP04me）。实验证实甲基化显著降低了降解剂在药理相关浓度下的PDE4D降解能力，但在高浓度时仍显示一定的脱靶活性。更重要的是，降解剂展现出与传统抑制剂不同的催化特性：在A549细胞中，BTX-AP08处理24小时后，即使洗脱化合物，PDE4D蛋白水平在48小时内仍保持低位，表明蛋白再合成速率较慢，降解剂具有长效作用优势。

3.3. PDE4降解剂在抑制炎性细胞因子方面优于PDE4抑制剂

在抗CD3ε和抗CD28抗体刺激的PBMC模型中，研究人员系统评估了多种化合物对炎性细胞因子释放的抑制能力。数据显示，先导降解剂BTX-AP04和BTX-AP05对肿瘤坏死因子α（TNFα）的半数抑制浓度（IC₅₀）比临床使用的Apremilast低1000倍，对其他细胞因子（如IFNγ、IL-2、IL-1β等）也表现出相似的高效力。

通过CRBN竞争实验，研究人员进一步证实了降解活性的特异性。当加入100倍摩尔浓度的CRBN竞争剂时，降解剂的效力下降约200倍，其IC₅₀值与Apremilast相当。同时，BTX-AP04me完全丧失了抑制炎性细胞因子表达的能力。安全性评估显示，先导降解剂对CRBN已知新底物（如Sall4、Aiolos、Ikaros等）的稳定性没有影响，表明其具有较高的特异性。

3.4. PDE4降解剂在特应性皮炎小鼠模型中展现良好的暴露量和疗效

药代动力学研究显示，不同结构的降解剂具有不同的物种特异性。BTX-AP02能够降解小鼠和人的PDE4D，但口服生物利用度较低（0.44%）；而BTX-AP04仅降解人源PDE4D，口服生物利用度达14.6%，暴露量（AUC）为7030 hr*ng/mL。

在oxazolone诱导的小鼠特应性皮炎模型中，腹腔注射BTX-AP02能够剂量依赖性地降解脾脏和关节组织中的PDE4D，且对CRBN新底物（Aiolos、Ikaros、CK1α）没有影响。疗效实验表明，BTX-AP02在减轻耳部肿胀方面与已批准疗法（地塞米松、Apremilast、Ruxolitinib等）效果相当。更重要的是，降解剂在耳组织中显著降低了IL-2、IL-4、IL-6等炎性细胞因子的水平，且效果优于Ruxolitinib。

3.5. 口服生物可利用的PDE4降解剂在GvHD模型中表现更优疗效

研究团队还开发了口服生物利用度更高的降解剂（BTX-AP04、BTX-AP06、BTX-AP07），其口服生物利用度在14.6%-29%之间。在人工PBMC诱导的NCG小鼠GvHD模型中，口服BTX-AP04治疗显著提高了小鼠生存率，效果优于PDE4抑制剂和环孢素A，与JAK1/2抑制剂Ruxolitinib相当。

血浆细胞因子分析显示，BTX-AP04治疗组小鼠的TNFα水平显著低于其他治疗组。从第16天到第42天，所有治疗组的GvHD评分均显著低于对照组。这些结果表明，PDE4降解不仅能够有效下调TNFα表达，还能延迟GvHD症状的出现。

研究结论与讨论部分强调了PDE4降解剂相对于传统抑制剂的独特优势。通过CRBN介导的泛素-蛋白酶体途径特异性降解PDE4B/D，降解剂能够更有效地积累cAMP，进而抑制蛋白激酶A（PKA）-cAMP反应元件结合蛋白（CREB）通路活化，最终减少核因子κB（NFκB）等转录因子的活性，降低T_H1、T_H2、T_H17等免疫细胞的炎性细胞因子释放。

与传统"占据驱动"的抑制剂不同，降解剂的催化作用机制使其能够以更低剂量、更少频次给药，同时由于血脑屏障透过性低，可能减少中枢神经系统相关副作用。此外，降解剂对PDE4B和PDE4D亚型的选择性降解，避免了同时抑制所有PDE4亚型可能带来的脱靶效应。

该研究不仅为特应性皮炎的治疗提供了新策略，也为其他PDE4相关疾病（如银屑病、慢性阻塞性肺疾病等）的药物研发开辟了新方向。随着蛋白降解技术的不断发展，PDE4降解剂有望成为下一代抗炎治疗的重要工具，为慢性炎症性疾病患者带来更安全、有效的治疗选择。