植物源免疫纳米颗粒的绿色合成及其对斑节对虾免疫增强和抗弧菌潜力的研究

《Microbial Pathogenesis》：Phytochemical profiling and bioefficacy of Atropa belladonna root extract and its green-synthesized zinc oxide nanoparticles: Antioxidant, antibacterial, insecticidal, and antiproliferative potentials

本综述系统探讨了利用孟加拉国药用植物（ Tulsi、Amloki、Dumur、Pepe、Haritaki）提取物绿色合成多金属免疫纳米颗粒（P-INPs），及其在可持续水产养殖中增强斑节对虾（Penaeus monodon）免疫、促进生长和提高对副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）抵抗力的潜力。研究表明，植物提取物中的生物活性成分（如多酚、类黄酮）不仅作为还原剂和封端剂参与了纳米颗粒（尺寸29–84 nm）的绿色合成，其与纳米银（AgNPs）等金属元素的协同作用更显著提升了虾的先天免疫指标（如溶菌酶、酚氧化酶活性、血细胞总数）并上调了关键免疫基因（PmIRF, PmVago, ProPO等）的表达，同时对养殖水体无显著毒性，为替代抗生素防控虾急性肝胰腺坏死病（AHPND）提供了环保新策略。

　　

Highlight

材料与方法

本研究采用的材料和方法根据先前发表的与绿色纳米颗粒合成、对虾营养和水生免疫学相关的方法学进行了总结和提炼（Fadel et al., 2025a; Fadel et al., 2025b; Raja et al., 2025）。对虾的收集、驯化、饲料制备和维护程序遵循国际水产养殖研究标准，确保了环境和生物参数的可靠性。

实验对虾与饲养条件

总共3000尾斑节对虾（Penaeus monodon）后期幼体（PL）从位于孟加拉国库尔纳Botiaghat的商业虾场采集，并运往杰索尔科技大学（JUST）渔业与海洋生物科学系的FHB现代化孵化场进行投喂试验（图1）。对虾被随机分配到六个处理组，包括一个对照组和十一个添加了由十五种植物介导的金属纳米颗粒的饲料组。

植物提取物衍生纳米颗粒在斑节对虾中的毒性评估（LD₅₀测定）

在进行免疫学和抗病力试验之前，对植物提取物衍生的纳米颗粒进行了急性毒性评估，以确定其半致死浓度（LD₅₀）。健康的斑节对虾（Penaeus monodon）幼虾（平均体重1.5 ± 0.2 g）在控制环境条件下（温度28–30 °C，盐度25–30 ppt，pH 7.8–8.2，溶解氧 > 5.0 mg/L）驯化七天。毒性试验遵循经济合作与发展组织（OECD）指南。

植物材料收集与制备

从孟加拉国本地经鉴定的来源采集了Tulsi（Ocimum sanctum）叶片、Amloki（Emblica officinalis）果实、Dumur（Ficus racemosa）树皮、Pepe（Carica papaya）果实和Haritaki（Terminalia chebula）干果的新鲜植物材料，采集季节为生物活性成分含量高峰期（图1）。每份植物标本均由植物学家进行植物分类学验证以确保物种身份。采集后，植物材料立即运往实验室。

生物活性化合物提取

首先，使用分析天平精确称取10克精细研磨的植物材料粉末。对于绿色纳米颗粒合成中常用的水提取法，将粉末与100毫升蒸馏水（1:10 w/v 比例）在洁净的锥形瓶中混合。混合物在60°C下使用磁力搅拌器连续搅拌45分钟，以促进黄酮类化合物、酚类和单宁等水溶性生物活性化合物的高效提取。搅拌后，将混合物通过Whatman 1号滤纸过滤。滤液在4°C下以10,000 rpm离心20分钟，收集上清液。最终提取物储存在4°C冰箱中，供后续纳米颗粒合成使用。

多金属免疫纳米颗粒的合成与纯化

通过将分析纯的金属硝酸盐溶解在超纯蒸馏水中，制备银硝酸盐（AgNO₃）、六水合硝酸锌（Zn(NO₃)₂·6H₂O）、三水合硝酸铜（Cu(NO₃)₂·3H₂O）、九水合硝酸铁（Fe(NO₃)₃·9H₂O）、六水合硝酸镍（Ni(NO₃)₂·6H₂O）、四水合钼酸铵（(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O）和三水合氯金酸（HAuCl₄·3H₂O）的水溶液前体，浓度均为1 mM。混合溶液作为多金属来源。将10毫升每种植物提取物（Tulsi, Amloki, Dumur, Pepe, Haritaki）分别加入到100毫升的1 mM混合金属硝酸盐溶液中。反应混合物在70°C水浴中温和加热并磁力搅拌（300 rpm）60分钟。观察到溶液颜色从浅黄色变为深棕色，表明纳米颗粒形成。合成后，纳米颗粒悬浮液在4°C下以12,000 rpm离心30分钟，沉淀物用蒸馏水洗涤三次以去除未反应的离子和植物残留物。最终纯化的纳米颗粒在60°C烘箱中干燥过夜，研磨成细粉，并储存在干燥器中以备进一步表征和使用。

生物活性化合物的表征

对所选孟加拉国药用植物的生物活性化合物的表征通过植物化学筛选和先进仪器技术相结合进行，以鉴定和分析负责生物活性的关键成分（图1）。初步的定性植物化学检测确定了重要的次级代谢产物，如黄酮类、生物碱、单宁、酚类化合物、萜类、甾体、醌类和香豆素类。采用稀释氨水后加浓硫酸的显色反应检测黄酮类。生物碱通过Mayer试剂（碘化汞钾溶液）检测。单宁通过明胶-盐溶液测试检测。酚类化合物通过三氯化铁（FeCl₃）测试检测。萜类通过Salkowski反应（氯仿和浓硫酸）鉴定。甾体通过Liebermann-Burchard测试（乙酸酐和浓硫酸）检测。醌类通过与氢氧化钠（NaOH）的显色反应鉴定。香豆素类通过荧光特性在紫外灯下观察。傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析在4000-400 cm^-1范围内进行，以识别官能团。气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析使用配备DB-5MS毛细管柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）的Agilent 7890B-5977A GC-MS系统进行，以鉴定挥发性化合物。电感耦合等离子体光学发射光谱法（ICP-OES）用于量化必需微量元素（Zn, Cu, Fe, Ag）的浓度。高效液相色谱（HPLC）用于定量特定的生物活性化合物，如没食子酸、槲皮素和鞣花酸。

免疫纳米颗粒的表征

免疫纳米颗粒的表征首先用去离子水反复洗涤合成的颗粒以去除杂质和未反应的残留物（图1）。将洗涤后的纳米颗粒悬浮在蒸馏水中，并使用磁力搅拌器以200 rpm连续搅拌30分钟以获得均匀分散体。悬浮液通过0.22 μm膜过滤器过滤以去除聚集体和较大颗粒。过滤后，溶液在4°C下以15,000 rpm离心45分钟以获得颗粒沉淀。将沉淀重新悬浮在无菌蒸馏水中，并通过动态光散射（DLS）和Zeta电位分析仪分析粒径分布、多分散指数（PDI）和Zeta电位。通过紫外-可见光谱（UV-Vis）在300-700 nm波长范围内扫描样品，观察表面等离子体共振（SPR）峰以确认纳米颗粒形成。通过X射线衍射（XRD）分析使用Cu Kα辐射（λ = 1.5406 ?）在2θ角度10°至80°范围内进行，以确定晶体结构和相组成。通过场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）在15 kV加速电压下观察形态，并通过能量色散X射线光谱（EDX）进行元素分析。通过高分辨率透射电子显微镜（HR-TEM）在200 kV加速电压下进一步分析粒径、形状和晶体结构。通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）在4000-400 cm^-1范围内分析官能团，以鉴定植物提取物中负责还原和封端纳米颗粒的生物分子。

通过SEM-EDX表征

首先为形态分析制备从Tulsi（Ocimum sanctum）、Amloki（Emblica officinalis）、Dumur（Ficus racemosa）、Pepe（Carica papaya）和Haritaki（Terminalia chebula）提取的生物活性化合物的干燥粉末样品。将粉末使用双面导电碳胶带安装在铝桩上。为防止充电并提高成像质量，样品溅射镀上一层薄金膜（约10 nm厚）。将镀膜样品装入扫描电子显微镜（SEM）样品室，在15 kV加速电压和高真空条件下观察。使用二次电子探测器获得表面形态图像。对于能量色散X射线光谱（EDX）分析，将电子束聚焦在感兴趣区域，并收集X射线光谱以进行元素定性和定量分析。所有测量均在三份样品上进行以确保结果的可重复性。

通过FTIR表征

使用傅里叶变换红外光谱（FTIR）对生物活性化合物和免疫纳米颗粒进行表征，以识别和分析负责其化学性质和生物活性的官能团（Kassem et al., 2023; Khakhalary and Narzari, 2025; Kiyimba et al., 2025; Pasieczna-Patkowska et al., 2025; Subramanian, 2009）。首先，将植物提取物（Tulsi, Amloki, Dumur, Pepe, Haritaki）和合成纳米颗粒的干燥粉末样品与光谱级溴化钾（KBr）以1:100的比例（样品：KBr）仔细混合。使用液压机将混合物压制成透明颗粒。将颗粒安装在样品架上，并放入FTIR光谱仪的样品室中。光谱在4000至400 cm^-1的中红外范围内记录，分辨率为4 cm^-1，扫描次数为32次。通过将获得的光谱与已知官能团的标准吸收带进行比较来解析光谱。

X射线衍射（XRD）方法

本研究使用X射线衍射（XRD）分析（Majithia and Barretto, 2023; Mardani et al., 2018; Sharma et al., 2012）来确定由（Abada et al., 2024; Alharbi et al., 2022; Antunes Filho et al., 2023; Gohil et al., 2024; Pandey et al., 2025）使用各种植物提取物合成的纳米颗粒的晶体结构和相组成。将干燥的纳米颗粒粉末仔细研磨并安装在平坦的零背景样品架上以确保最佳反射几何。使用配备Cu Kα辐射源（波长λ = 1.5406 ?）的X射线衍射仪在40 kV电压和30 mA电流下运行。以0.02°的步长和2秒/步的停留时间在10°至80°的2θ范围内进行扫描。将获得的衍射图与JCPDS（粉末衍射标准联合委员会）数据库中的标准图谱进行比较，以鉴定存在的结晶相。使用Scherrer方程根据衍射峰宽计算平均晶粒尺寸。

抗菌性能评估

针对影响斑节对虾（Penaeus monodon）的病原体副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的抗菌性能评估（Li, J. et al., 2024; Moliva et al., 2023; Singh et al., 2024）使用植物提取物（Tulsi, Amloki, Dumur, Pepe, Haritaki）及其合成的银纳米颗粒（Tu-AgNPs, Am-AgNPs, Du-AgNPs, Pe-AgNPs, Ha-AgNPs）进行。首先，从甘油储备液中复苏副溶血弧菌，并在30°C、200 rpm摇荡条件下在海洋卢里亚伯特尼（MLB）肉汤中过夜培养。通过测量600 nm光密度（OD₆₀₀）将细菌悬浮液调整至约1×10⁸ CFU/mL（0.5 McFarland标准）的浓度。通过琼脂扩散法评估抗菌活性。将100 μL细菌悬浮液均匀涂布在MLB琼脂平板上。在琼脂上打孔（直径6 mm），并分别加入100 μL每种植物提取物（100 mg/mL）或纳米颗粒悬浮液（100 μg/mL）。将平板在30°C培养24小时。通过测量抑菌圈直径（以毫米计）来评估抗菌活性。还通过微量肉汤稀释法测定最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）。将纳米颗粒悬浮液在MLB肉汤中进行系列稀释（浓度范围0.78至100 μg/mL），并在96孔板中与等体积细菌悬浮液（5×10⁵ CFU/mL）孵育。在30°C培养24小时后，通过加入刃天青溶液（0.015% w/v）进行显色反应来测定MIC，颜色从蓝粉色变为粉色表示细菌生长。通过将MIC测定中未见生长的孔内容物划线接种到新鲜MLB琼脂平板上并计数菌落来测定MBC。所有实验均独立进行三次。

纳米颗粒制剂的确切组成和浓度

使用选自孟加拉国的药用植物水提取物合成了五种不同的纳米颗粒制剂：Tulsi（Ocimum sanctum）、Amloki（Emblica officinalis）、Dumur（Ficus racemosa）、Pepe（Carica papaya）和Haritaki（Terminalia chebula）。每种制剂均由银纳米颗粒（AgNPs）组成，通过用相应的植物提取物还原1 mM硝酸银水溶液制得，植物提取物与硝酸银溶液的混合比例为10 mL植物提取物对应100 mL硝酸银溶液。合成后，通过离心纯化纳米颗粒，并重新悬浮在无菌蒸馏水中。最终纳米颗粒悬浮液的浓度使用纳米颗粒跟踪分析（NTA）和电感耦合等离子体光学发射光谱法（ICP-OES）进行标准化。用于投喂试验的工作浓度通过将储备悬浮液用无菌蒸馏水稀释至所需浓度（例如，25、50、100 μg/g饲料）来制备。

生物活性化合物和免疫纳米颗粒的表征

对植物提取物（Tulsi, Amloki, Dumur, Pepe, Haritaki）及其相应合成的纳米颗粒（Tu-AgNPs, Am-AgNPs, Du-AgNPs, Pe-AgNPs, Ha-AgNPs）中生物活性化合物的表征显示，所有样品均含有复杂的植物化学成分阵列，并表现出与针对斑节对虾（Penaeus monodon）中副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的抗菌和免疫调节活性相关的独特纳米尺度特征。

扫描电子显微镜（SEM）和EDX分析

扫描电子显微镜（SEM）分析显示，多金属纳米颗粒呈球形，形态稳定，粒径范围在29至84纳米之间。EDX分析证实了银（Ag）作为主要成分的存在，并补充有锌（Zn）、铜（Cu）、铁（Fe）以及源自植物提取物的有机植物化学封端剂提供的微量元素。

讨论

研究结果表明，通过绿色化学方法（Eker et al., 2025; M.Devikarani and Gopi, 2025; Osman et al., 2024; Prashanth et al., 2025）合成的植物源免疫纳米颗粒能有效增强对虾免疫力（dos S. Filho et al., 2023; Eissa et al., 2025; Elias et al., 2025; Kumar, S. et al., 2023），并对副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）感染提供显著保护（Ghosh et al., 2021; León-Valdez et al., 2024; Pooljun et al., 2025; Zha et al., 2023）。

结论

利用Tulsi（Ocimum sanctum）、Amloki（Emblica officinalis）、Dumur（Ficus racemosa）、Pepe（Carica papaya）和Haritaki（Terminalia chebula）提取物绿色合成纳米颗粒，成功制备了尺寸为29–84 nm的稳定球形纳米结构。在饲料中添加这些免疫纳米颗粒显著改善了虾的生长、免疫酶活性以及对副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的抵抗力。Dumur来源的锌纳米颗粒（DuZnNPs）通过提高存活率（96%）、增重（24%）以及增强关键免疫参数（溶菌酶、酚氧化酶活性、血细胞总数），同时调节细胞因子谱和上调免疫相关基因（PmIRF, PmVago, ProPO, Penaeidin），产生了最大的益处。这些发现突出了植物源纳米颗粒作为抗生素替代品在可持续虾类养殖中管理疾病（如AHPND）的潜力。