基于连接引发LAMP与分子信标的多模式核酸检测策略用于碳青霉烯酶耐药基因组合检测

本文报道了一种基于连接引发环介导等温扩增（LAMP）与分子信标（MB）的多模式检测新策略，可实现碳青霉烯酶耐药基因的单重、双重及三重组合检测。该技术通过模块化设计（通用引物与信号探针）显著简化检测体系优化流程，利用MB探针实现闭管实时荧光检测以避免气溶胶污染。方法在无需细菌培养前提下，对临床分离株与环境样本中碳青霉烯酶基因（如KPC、NDM等）检测灵敏度达aM级别，为资源有限场景下耐药基因现场快速检测提供高效技术方案。

　　

^1.亮点

• 开发了一种基于连接引发LAMP和分子信标的多模式检测策略

• 支持碳青霉烯酶耐药基因的单重、双重及三重组合检测

• 单重检测灵敏度高达~aM（10^-18 M）水平

• 模块化设计实现"通用引物+可变识别探针"的灵活组合

• 分子信标实现闭管实时荧光检测，避免开盖污染

^2.材料与试剂

T4 DNA连接酶、Bst 2.0 DNA聚合酶、10×等温缓冲液（10×Iso）和脱氧核苷酸（dNTP）溶液混合物购自New England Biolabs公司（美国伊普斯维奇）。快速质粒小提试剂盒购自Vazyme公司（中国江苏）。SYBR Green I购自北京索莱宝科技有限公司。快速细菌基因组DNA提取试剂盒和本研究使用的寡核苷酸均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

^3.检测原理概述

如方案1所示，该系统由识别探针组、引物组（含前向引物FP、反向引物RP和环引物LP）及信号探针（MB）构成。其中引物组和信号探针固定不变，而识别探针组的紫色区域是唯一针对不同耐药基因设计的可变区。识别探针组由一对茎环结构探针（左杂交探针LHP和右杂交探针RHP）及0-2个中间探针（IP）组成，IP数量取决于待检测耐药基因的类型。

^4.结论

本研究构建了一种基于连接引发LAMP和MB的多模式检测策略，用于碳青霉烯酶耐药基因的组合检测。该策略支持单重、双重及三重检测模式，能同时检测1-3种碳青霉烯酶耐药基因。单重检测模式展现出超高灵敏度，可检测~aM水平的耐药基因；多重检测模式则能同步提供多种耐药基因信息，显著降低检测成本。这种"通用引物+模块化探针"的设计思路大幅简化了检测体系的优化流程。同时，MB信号探针通过特异性杂交实现闭管实时荧光检测，有效避免染料非特异性嵌入导致的假阳性。本策略已成功应用于临床分离株和环境样本的直接检测（无需细菌培养），为资源有限场景的现场快速检测提供了高效、便捷的技术手段。