综述：亚硝胺在强化艾姆斯试验中的致突变性：菌株、代谢和溶剂效应综述

《Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis》：Mutagenicity of nitrosamines in enhanced Ames tests: a review of strain, metabolism, and solvent effects

本综述系统评述了强化艾姆斯试验（EAT）检测N-亚硝胺（NA）致突变性的关键要素，推荐采用包含敏感菌株（如沙门氏菌TA1535和大肠杆菌WP2 uvrA (pKM101)）、高浓度（30% v/v）仓鼠肝S9（富含CYP2E1/CYP2C19）及兼容溶剂（如DMSO）的分层策略，为遵循ICH M7 (R2)等指南进行稳健的药品杂质风险评估提供了有力支持。

　　

文献识别与纳入标准

本研究采用系统性的文献检索方法，筛选出六项符合OECD测试指南471和ICH M7 (R2)建议的强化艾姆斯试验（EAT）研究，这些研究均使用了至少三种经认可的细菌测试菌株，包括沙门氏菌TA98、TA100和TA1535。

结果

六项近期的EAT研究结果被汇总比较，以深入理解亚硝胺的检测特性。分析重点集中在菌株敏感性、代谢活化系统和溶剂兼容性等关键参数上。

菌株对亚硝胺的敏感性

在评估的细菌测试菌株中，大肠杆菌WP2 uvrA (pKM101)和沙门氏菌TA1535与TA100对短链烷基亚硝胺（如NDMA、NDEA、NDPA和CPNP） consistently表现出最高的敏感性。综合分析表明，TA1535是其中最敏感的菌株，尤其是在采用30% v/v仓鼠肝S9进行预孵育的方案中。这种高敏感性源于TA1535对其hisG46位点GC→AT碱基对置换的特异性检测能力，而这类突变通常由O⁶-烷基鸟嘌呤DNA加合物所诱导。菌株TA100的反应存在变异性，而TA98和TA1537则普遍呈现阴性结果。这凸显了针对亚硝胺主要致突变机制（即碱基对置换）选择合适菌株的重要性。

代谢活化：S9来源和浓度的影响

代谢活化是检测亚硝胺致突变性的关键环节。研究数据明确显示，富含特定细胞色素P450（CYP）同工酶（尤其是CYP2E1和CYP2C19）的仓鼠肝S9，其活化效率显著高于大鼠肝S9。将S9的使用浓度提高至30% (v/v) 进一步增强了代谢活化能力，从而提高了检测灵敏度。这为在EAT协议中优先选用高浓度仓鼠肝S9提供了实验依据。

溶剂兼容性

溶剂的选择对试验结果有显著影响。研究证实，N-甲基-2-吡咯烷酮（NMP）和乙酸乙酯等溶剂即使在低剂量（如每板10 μL）下也会抑制S9酶的活性。相比之下，二甲基亚砜（DMSO）在高达1.6% (v/v)的浓度下仍表现出良好的兼容性，且溶解能力强、细胞毒性低，因此被推荐为亚硝胺EAT的首选溶剂。水也被证明是兼容的溶剂。

化合物纯度

为避免假阳性结果，所有纳入研究的亚硝胺化合物均通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）确认具有高纯度（>98%）。此外，研究中还采用了谷胱甘肽共孵育策略，以淬灭过量的烷化剂，确保检测到的是真实的致突变信号而非非特异性烷化作用。

结论

强化艾姆斯试验（EAT）检测亚硝胺（包括药物中亚硝胺杂质，NDSRIs）致突变性的灵敏度，取决于菌株选择、代谢活化、溶剂兼容性和化合物纯度等多个因素。沙门氏菌TA1535和大肠杆菌WP2 uvrA (pKM101)对短链及结构多样的亚硝胺 consistently 给出最强的反应，尤其是在与30% (v/v)仓鼠肝S9联用时。本文提出的分层EAT策略（即优先使用TA1535、WP2 uvrA、仓鼠S9和经过验证的溶剂）能够提供一个可重复、机制明确且符合法规要求的方法，用于对亚硝胺致突变性进行稳健的风险评估，这与ICH M7 (R2)、OECD TG471以及FDA和EMA的现行指南精神相一致。