综述：细胞外囊泡靶向递送跨越生理屏障的理性设计

《Nano Today》：Rational design of extracellular vesicles for targeted drug delivery across physiological barriers

本综述系统探讨了细胞外囊泡（EVs）作为下一代药物递送载体的临床转化挑战与工程策略。文章深入分析了EVs在软骨、血脑屏障（BBB）、眼部和胃肠道等生理屏障中的药代动力学（PK）与转运机制，并提出通过组织特异性配体（如RVG29、CAP肽）和组织非依赖性策略（如电荷修饰、CPC肽）增强靶向性的理性设计原则。同时比较了EVs与合成载体（如脂质体、AAV）在生物分布、细胞摄取和安全性方面的优劣，为克服临床转化瓶颈（如GMP生产、稳定性）提供了关键见解。

　　

引言

纳米疗法的进步使靶向药物递送日益可行。通过定制合成载体的理化性质（如尺寸、电荷和表面化学），研究人员提高了靶向效率。然而，这些系统仍面临关键挑战，包括在复杂组织微环境中的体内稳定性有限、重复给药限制、长期安全性问题、免疫原性和不确定的细胞内运输。因此，天然衍生的纳米载体作为有前景的替代品出现，有望克服这些限制并重新定义靶向药物和基因递送的格局。

细胞外囊泡（EVs）是由生物源（包括动物、植物和细菌细胞）天然分泌的非核脂质纳米结构。这些细胞外纳米囊泡具有膜结合结构，类似于其亲本细胞的脂质双层组成。基于生物发生途径，EVs可分为“外泌体”（30-200 nm）和“ectosomes”（200-1000 nm）。尽管历史上被忽视为单纯的细胞碎片，但最近关于EVs生物学功能的见解，特别是它们在细胞间通信和从细胞起源继承的生物货物方面的重要性，导致它们作为诊断标志物和纳米治疗剂的广泛应用。EVs作为药物递送载体的认可主要归因于其生物起源，与合成对应物相比具有低免疫原性。EVs从亲本细胞继承跨膜蛋白和受体，为它们提供天然的组织归巢能力，并通过配体-受体相互作用/膜融合增强受体细胞的摄取。最后，它们跨越生物屏障和耐受恶劣生物流体的先天能力使这些天然衍生的囊泡成为有前景的药物递送载体和无细胞纳米治疗剂。此外，EVs适用于多种工程策略——物理、化学和遗传——用于货物装载和表面修饰，增强其在靶向递送应用中的效用。

工程化EVs：克服软骨屏障

肌肉骨骼关节是一个高度异质的环境，由多种细胞类型组成，包括成纤维细胞样滑膜细胞、巨噬细胞、软骨细胞、成骨细胞/破骨细胞和间充质干细胞（MSCs）。EVs通过促进生物大分子的细胞间转移，在维持关节稳态中发挥关键作用，从而调节细胞外基质（ECM）的形成和降解以及调节炎症。

EVs在关节稳态中的作用首先由Bonucci和Anderson的实验室揭示，他们独立发现由成熟软骨细胞和成骨细胞分泌的基质囊泡参与软骨内骨化。这些囊泡含有生长因子、酶和信号分子，包括骨形态发生蛋白、血管内皮生长因子（VEGFs）和基质金属蛋白酶（MMPs），表明这些囊泡作为组织生长和关节重塑中的旁分泌介质的重要性。滑液（SF），关节的润滑液，含有来自各种细胞类型的EVs——包括滑膜成纤维细胞、血小板、红细胞、中性粒细胞、单核细胞和T细胞——它们在类风湿关节炎（RA）和骨关节炎（OA）的炎症发病机制中发挥关键作用，通过穿梭炎症细胞因子、非编码RNA和酶。免疫细胞衍生的EVs是滑膜和软骨中炎症传播的早期介质。例如，M1极化巨噬细胞衍生的EVs被软骨细胞摄取导致IL-6、IL-8、IL-1β和MMPs的产生增加，这些是软骨ECM降解的关键促进剂。各种miRNA，包括miR-449a-5p、miR-146、miR-26a、miR-34a和miR-210，在来自关节炎软骨细胞和滑膜成纤维细胞的EVs中发现，诱导促炎效应。虽然大部分货物穿梭通过SF发生，但在发炎关节的组织重塑过程中，骨和软骨之间也存在串扰。破骨细胞衍生的EVs通过miR-214-3p的转移降低了软骨细胞对ECM降解的抵抗力，促进了骨软骨血管生成，并增加了感觉神经支配。类似地，Liu及其同事发现，通过来自OA患者的破骨细胞衍生的EVs转移miR-23b-3p促进了OA进展。虽然EVs在关节病理生理学中发挥关键作用，但某些EV群体，特别是MSC衍生的EVs，富含miR-126、miR-140和miR-199a-3p，抑制软骨细胞和滑膜成纤维细胞中的炎症途径并促进细胞增殖。此外，来自滑膜成纤维细胞、中性粒细胞和M2巨噬细胞的EVs通过非编码RNA介导的组织再生和抗炎作用显示出治疗益处。因此，了解EV介导的关节信号传导为利用其潜在有益效果提供了治疗途径。

虽然前景广阔，但将EVs作为关节治疗剂使用面临重大的转运和递送挑战，阻碍了它们精确靶向软骨。目前，不存在疾病修饰OA药物（DMOADs），主要是由于缺乏安全有效的药物递送系统，可以特异性靶向软骨并向软骨细胞递送持续剂量的治疗剂。为了增加关节中的局部药物浓度，可以使用关节内注射（IA）；然而，通过滑膜中的血管和淋巴管的快速药物清除仍然是一个主要限制。EVs也类似地受到这种短关节停留时间的影响，由于它们的纳米尺寸范围，类似于其他递送载体的关节PK曲线。

然而，由于软骨降解是炎症性关节疾病的主要痛苦，到达软骨细胞对于逆转OA仍然至关重要。尽管如此，软骨本身作为DMOADs转运的主要组织屏障。作为一种无血管、无淋巴和无神经的组织，软骨由密集的胶原纤维与聚集蛋白聚糖蛋白聚糖交织组成，这些蛋白聚糖含有高度带负电荷的糖胺聚糖（GAGs）。高浓度的GAGs为组织提供了约-170 mM的整体净负固定电荷密度（FCD），阻止大多数带负电荷的治疗性生物大分子（包括蛋白质和核酸）的转运。至关重要的是，EVs的带负电荷的脂质双层由于与GAGs的排斥相互作用限制了它们穿透软骨ECM的能力。尽管EVs用于肌肉骨骼疾病仍处于早期阶段，但两项正在进行的试验正在测试脐带MSC衍生的外泌体（CelliStem?OA-sEV, Cells for Cells, NCT05060107）和血小板衍生的外泌体（PEP?, Rion, NCT06463132）的IA递送。了解EVs的天然功能及其与关节常驻细胞的相互作用为工程化EVs有效靶向关节组织奠定了基础。为了解决这个问题，许多研究探索了工程策略——如治疗性货物装载和表面修饰——以增强EVs在软骨内的穿透和保留，从而改善对嵌入软骨细胞的访问。

软骨靶向分子

关节EVs的工程化通常分为两类：细胞和组织靶向。对于软骨细胞靶向，一种常见方法是使用软骨细胞亲和肽（CAP）工程化EVs。CAP是一种通过噬菌体展示技术鉴定的软骨细胞归巢肽。来自细胞源（如皮下脂肪衍生的MSCs、Expi293F和树突状细胞）的EVs已被设计为在其表面展示CAP，并通过软骨细胞靶向递送miRNA和siRNA证明了改善的治疗益处。另一种细胞靶向方法是使用MSC结合肽。为了有效地将kartogenin递送至关节炎关节中的MSCs，Duan及其同事利用负载kartogenin并表面修饰有MSC结合肽E7的树突状细胞衍生的EVs。这种方法实现了MSCs的选择性靶向，促进了软骨细胞分化，从而促进了软骨再生。EVs的其他潜在靶向分子包括叶酸修饰的透明质酸、抗CD16/32抗体、硫酸葡聚糖、腺苷和HAP-1肽，这些在其他纳米载体的工程化中显示出靶向滑液衍生的巨噬细胞和滑膜成纤维细胞的潜力。

虽然细胞靶向策略提供了高尺度特异性，但这些方法仍然不能克服固有的关节组织屏障。EVs工程化用于组织靶向主要集中于胶原等软骨成分。Liu及其同事在人间充质干细胞衍生的EVs表面使用胶原II靶向肽（WYRGRL），一种6氨基酸长的肽，用于软骨靶向， resulting in improved delivery of anti-inflammatory miRNAs to chondrocytes and effective cartilage repair after OA onset in vivo。其他靶向胶原的方法包括使用胶原II抗体和avimers作为EVs的靶向分子。软骨的负FCD提供了一个独特的机会，利用静电相互作用通过带阴离子的GAGs进行弱可逆结合，从而促进载体扩散到软骨的全深度，并允许治疗药物到达居住在深区的软骨细胞。最佳带电的纳米载体，如亲和素和短长度富含精氨酸的阳离子肽载体（CPC），净电荷为+14，已显示增强从小分子到更大蛋白质基治疗和诊断的组织穿透和保留。Bajpayee及其同事利用CPC缀合的外泌体用于mRNA递送至软骨的深区，实现了比天然外泌体更大的组织穿透和有效的基因递送。利用这些工程化外泌体，同一组还有效地将重组IL-1受体拮抗剂（IL-1RA）递送至早期关节炎软骨组织，与天然外泌体相比，单次剂量抑制了IL-1诱导的分解代谢。他们的实验室还建立了亲和素和CPCs的安全性概况，显示无细胞毒性证据、无免疫原性反应以及对软骨电机械特性的最小影响。类似地，Feng及其同事通过使用聚赖氨酸缀合的MSC衍生的EVs用于OA治疗， resulting in enhanced cartilage uptake, cartilage penetration, and improved therapeutic outcomes。靶向聚集蛋白聚糖使能够通过导航EVs进入软骨并增强软骨细胞摄取来实现组织和细胞特异性靶向。此外，为了促进持续递送、减少IA注射频率并改善关节停留时间，EVs可以并入微粒系统或水凝胶中。该设计原则在PEP?制剂的临床试验中被采用，其中血小板衍生的外泌体负载在透明质酸基水凝胶中。总体而言，静电电荷相互作用与持续递送平台相结合，提出了一种合理有效的策略，以改善肌肉骨骼疾病的关节内药物递送。

工程化EVs：克服血脑屏障

血脑屏障（BBB）对神经退行性疾病和胶质母细胞瘤的脑部药物递送构成重大挑战。这种选择性渗透膜由脑内皮细胞（ECs）通过紧密、粘附和间隙连接蛋白的密集堆积形成。BBB的连接复合物调节分子从血流进入大脑的运输。然而，EVs以其在细胞间通信中的作用而闻名，循环EVs具有绕过BBB的能力，使它们成为靶向递送和诊断的有前景的策略。

EVs在维持和扰乱脑稳态方面表现出双重作用，由它们固有的分子货物和各种BBB细胞类型继承的表面标志物介导。EVs的组成随其细胞起源和大脑的生理或病理状态而变化。神经元衍生的EVs（NDEVs）携带L1细胞粘附分子（L1CAM）和GluR2/3谷氨酸受体亚基，这些对突触功能至关重要，以及泛素羧基末端水解酶L1（UCH-L1），对轴突活动至关重要。神经元衍生的EVs（AB126, Aruna Bio）通过静脉内（IV）给药的潜力已在急性缺血性卒中模型中显示增强神经发生；该策略目前正在进行临床研究，IND已批准。小胶质细胞衍生的EVs（MDEVs）含有氨肽酶CD13和乳酸转运蛋白MCT-1，支持ATP生成以进行突触活动。在损伤修复期间，MDEVs富含miR-23a-5p，通过小胶质细胞的M2极化和少突胶质细胞前体细胞增殖促进神经保护。星形胶质细胞衍生的EVs（ADEVs）运输谷氨酸天冬氨酸转运蛋白和谷氨酰胺合成酶以调节突触传递，并携带载脂蛋白D，在氧化应激下支持神经元存活。少突胶质细胞衍生的EVs（ODEVs）富含髓鞘蛋白脂质蛋白（PLP）和2′,3′-环核苷酸磷酸二酯酶，两者对髓鞘形成和轴突营养支持至关重要。尽管具有神经保护功能，但EVs可以通过携带有毒和炎症货物传播疾病。NDEVs可能通过运输过度磷酸化的tau和β-淀粉样蛋白促进阿尔茨海默病（AD）进展。EVs还携带致病蛋白，如铜锌超氧化物歧化酶和α-突触核蛋白，促进肌萎缩侧索硬化（ALS）和帕金森病的传播。ADEVs通过运输超氧化物歧化酶1和反式激活反应DNA结合蛋白（TDP-43） implicated in ALS pathogenesis，这些在大脑中聚集并驱动神经退行性变。总体而言，EVs作为神经元健康和退化的介质。了解它们的分子特征和跨BBB的相互作用为开发诊断、预后和治疗策略提供了有前景的途径。

尽管EVs具有跨越BBB的特权，但只有不到1%的系统给药EVs设法穿越组织封锁。大多数IV注射的EVs由于广泛的血液毛细血管而积累在肝脏组织中，减少了它们在大脑组织中的生物利用度。大脑PK受EVs内在特征和生理因素复杂相互作用的 influenced。首先，EV运输严重依赖于其理化性质，如大小、表面电荷和密度。只有小于70 nm的小EVs可以绕过BBB， mainly via transcytosis governed by brain ECs。外源性EVs从循环进入脑ECs也通过受体介导的内吞作用、巨胞饮和膜融合过程介导。调节EV运输的另一个决定因素是ECs表面糖萼层携带的负电荷密度（-5.5 mM）。与软骨类似，内皮糖萼中的带负电荷GAGs也静电排斥EVs的阴离子脂质双层，限制了它们跨脑ECs的运输。在炎症期间，蛋白聚糖降解减少了表面负电荷，削弱了这种排斥并增强了EV渗透性。

类似地，EVs的密度是另一个关键因素，其中构成早期内体标志物（如Ras相关的Rab5a和EEA1（早期内体抗原-1））的高密度部分倾向于积累在BBB的腔外侧。相比之下，富含晚期内体标志物（如Lamp1和Lamp2蛋白）的低密度部分存在于腔侧。细胞归巢和跨细胞运输速率也由于差异表达的细胞表面受体或细胞外整合素而变化，这些由EVs携带，取决于它们的亲本细胞。尽管炎症条件下的泄漏BBB由于紧密连接和间隙连接蛋白的表达减少增强了EVs的细胞旁运输速率，但BBB附近不同类型免疫细胞的浸润可能扰乱常规运输。因此，第二个影响因素是免疫细胞的存在，如激活的小胶质细胞，在脑实质中，这增加了脱靶EV内化和降解其内部货物的机会。第三，跨越BBB的EVs由于它们的双向运输特性容易泄漏到循环中，减少了它们在深脑实质中的保留时间。最后，跨越内皮基底膜的EVs需要迁移约15 μm的距离以访问嵌入在深脑中的靶细胞，如星形胶质细胞和神经元。因此，超越EC层的运输和迁移到远端部位对于EVs作为有效纳米载体或靶向递送治疗剂至关重要。

BBB靶向分子

EVs的精确递送应旨在克服挑战，如1) BBB穿透和2) 对深脑实质中靶细胞类型的有限访问，从而促进神经系统疾病的有效治疗机会。这可以通过通过物理、化学或遗传工程方法缀合或内源性过表达特定细胞受体配体来定制EVs的理化性质来实现。Matthew Wood及其同事通过遗传工程方法将狂犬病毒糖蛋白（RVG29）缀合到树突状细胞衍生的外泌体的Lamp2b膜蛋白上，开创了这种方法。RVG29与脑ECs和神经元细胞上存在的烟碱乙酰胆碱受体具有高结合亲和力。RVG29肽后来成为工程化不同细胞类型EVs的流行靶向 motif。类似的方法被采用来工程化MSC衍生的外泌体以表达RVG29肽，从而改善靶向大脑皮层和海马体以调节AD进展。低密度脂蛋白受体（LDLRs）在BBB的腔侧表达。载脂蛋白（Apo）衍生肽序列可以利用来 enable interaction with LDLRs and augment EV brain trafficking。ApoB和ApoE与溶酶体酶的肽缀合物已显示有效运输蛋白质药物跨越BBB，并可用于工程化EVs。例如，ApoB衍生肽缀合到外泌体的CD9跨膜蛋白显示增强在脑中保留24小时。除了受体-配体相互作用，另一种增强BBB穿透的策略是利用脑内皮表面糖萼的阴离子结构域，类似于用于靶向软骨负FCD的工程化方法。这可以通过缀合或锚定EVs与阳离子细胞穿透肽（CPPs）（如TAT、PepH3、penetratin）来实现，这些在其他纳米载体和前药中显示出通过静电相互作用介导的吸附转胞作用绕过BBB的潜力。

Angiopep-2是工程化EVs的有效配体，能够靶向在ECs和肿瘤细胞上高度表达的LDL受体。用angiopep-2修饰的EVs enable dual targeting， facilitating both BBB penetration and enhancing glioblastoma tissue homing。类似地，转铁蛋白受体（Tfrs），也在内皮和肿瘤细胞上过表达，为胶质母细胞瘤提供另一种双靶向策略。靶向Tfrs的T7肽工程化外泌体 demonstrated significantly higher tumor suppression than native EVs。此外，葡萄糖转运蛋白1（GLUT1），在脑ECs上 abundantly expressed，使糖基化EVs能够作为BBB穿透和靶向递送的替代方法。在缺血性卒中中，基质衍生因子1（SDF-1）的上调增强了与CXCR4的相互作用；因此，过表达CXCR4的EVs可以有效地定位到缺血性脑病变。整合素αvβ3，在缺血条件下在ECs上高度表达，也可以使用含RGD的肽靶向。例如，用环状RGDyK肽工程化的外泌体实现了病变特异性生物分布比未修饰外泌体增加11倍， with enhanced uptake by astrocytes and neurons in the brain parenchyma。值得注意的是，这种相同的环状四肽也显示出对胶质母细胞瘤细胞的强亲和力，为通过工程化EVs靶向缺血和肿瘤区域提供双重效用。

虽然用多功能和天然分子工程化EVs是一种有前景的方法，但EVs可能遇到与它们系统循环中内在对应物的竞争性结合，减少它们在脑实质中的生物利用度。此外，非特异性靶向通常需要高剂量和频繁给药以实现治疗功效。这些限制可以通过鼻内EV递送来克服，已显示比系统途径获得更高的脑浓度。这种非侵入性方法通过细胞外途径通过嗅球直接访问脑组织。仍然，挑战存在，包括快速粘膜纤毛清除和需要优化的给药装置，这值得进一步研究。

（由于字符限制，以下部分继续以类似摘要方式覆盖剩余章节关键点）

工程化EVs：克服眼部屏障

EVs在维持眼部稳态和贡献于前和后眼段疾病（包括干眼症、年龄相关性黄斑变性（AMD）、青光眼和糖尿病视网膜病变）中发挥关键作用。角膜上皮细胞衍生的EVs含有血小板反应蛋白-2、CXCL5和潜伏TGF-β1等蛋白质，促进伤口愈合和新生血管形成。在视网膜，一个由血视网膜屏障（BRB）保护的免疫特权部位，各种细胞类型——包括视网膜色素上皮（RPE）、星形胶质细胞和Müller胶质细胞——分泌介导细胞间信号传导的EVs。星形胶质细胞EVs携带抗血管生成因子（内皮抑素、色素上皮衍生因子），而RPE衍生的EVs含有miR-182、miR-122和αB-结晶素以支持光感受器存活和分化。RPE-EVs也 known to contribute to AMD pathogenesis via cargo such as damaged mtDNA, Complement 3, VEGFR2, PDGF, and fibulin-3。光感受器衍生的EVs（PREVs）递送视觉色素如视紫红质和恢复蛋白。Müller胶质EVs表达谷氨酰胺合成酶（GS）和细胞视黄醛结合蛋白（CRALBP），影响视网膜循环和暗适应。最后，葡萄膜黑色素瘤患者玻璃体中的EVs显示miR-21、miR-34a和miR-14a水平升高， known for promoting tumor growth。

临床批准的眼部药物递送途径包括局部、全身和玻璃体内给药。局部应用是非侵入性和患者友好的，但由于多个静态和生理屏障，对前和后段的生物利用度极低。快速的泪液周转（～3分钟）通过鼻泪管消除了超过90%的滴注EVs。只有一小部分可以到达角膜。EVs <50 nm可能通过紧密连接细胞旁传递，而更大的EVs利用通过脂质相互作用的跨细胞 routes。然而，带负电荷、亲水的角膜基质（FCD ～ –50 mM）和晶状体囊的紧密网格限制了后部运输。此外，EVs通常通过结膜血管或淋巴管清除，只有<0.07%的局部应用剂量到达视网膜。这些药代动力学和运输限制突出了需要具有增强组织停留和视网膜穿透的工程化EVs。此类设计可以减少与重复玻璃体内注射相关的给药频率和风险，同时推进用于后段疾病的局部EV制剂。

有效的EV基眼部药物递送应靶向前段和视网膜层。对于前部递送，用亲水聚合物或带正电荷基序进行表面修饰可以增强角膜停留和持续释放， particularly beneficial in dry eye or glaucoma。为了通过全身途径实现视网膜靶向，EVs可以用利用BRB表达受体的配体工程化。由于BRB与BBB具有结构和分子相似性，常用于绕过BBB的细胞表面受体，如Tfrs、LDLRs和整合素，可以类似地用于工程化EVs用于BRB穿透和靶向视网膜递送。例如，Tfrs位于RPE细胞的基底外侧，当与Tfr靶向肽缀合时，可以使EV穿透通过脉络膜血管。类似地，RPE定位的LDLRs可以通过配体如ApoE、PDGF和乳铁蛋白靶向。环状RGD肽，靶向在新生血管AMD中上调的整合素αvβ5，也持有视网膜靶向的 promise。Tetraspanin结合肽（如CD63的CP05）为表面工程化提供了一种多功能方法。例如，CP05缀合的外泌体连接到抗血管生成肽KV11 showed effective endothelial targeting and neovascular suppression in oxygen-induced retinopathy models via both intravitreal and systemic administration。类似地，tetraspanin靶向策略已用于缀合VEGF抗体，抑制脉络膜新生血管形成。

为了克服角膜屏障并通过局部递送增强VH保留，EVs可以工程化用于非特异性、基于电荷的靶向，通过利用这些组织的负FCD，类似于用于靶向软骨和脑糖萼的策略。Bajpayee及其同事证明了这一点，使用牛奶衍生的外泌体功能化短精氨酸丰富的阳离子肽（CPCs）和亲水PEG基序。这些修饰的EVs显示改善的角膜穿透 due to their hydrophilicity and retinal distribution (from ILM to ONL) in bovine retina models， enabling targeted mRNA delivery to photoreceptors。增强扩散是由与VH和ILM中阴离子GAGs的弱可逆静电相互作用驱动的。然而，引入高密度阳离子电荷带有电荷屏蔽在带负电荷的角膜和晶状体内的风险， potentially leading to tissue deswelling and blurry vision。在这项工作中，作者使用了非常低浓度的电荷反转外泌体，没有诱导任何组织肿胀。此外