基于全基因组miRNA筛选鉴定可提高HEK293细胞重组腺相关病毒产量的microRNAs及其机制研究

《New Biotechnology》：A human genome wide screen identifies miRNAs to increase recombinant Adeno-associated virus production in HEK293 cells

本研究针对rAAV基因治疗载体生产产量低的瓶颈问题，通过全基因组miRNA模拟物文库筛选，在HEK293细胞中鉴定出144种能提高功能性rAAV滴度的miRNA，其中6种先导miRNA（hsa-miR-125a-5p等）在Ambr?15生物反应器系统中得到验证，可显著提高功能性rAAV滴度且不影响关键质量属性。该研究为利用miRNA工具优化rAAV生产提供了新策略。

　　

随着基因治疗时代的到来，重组腺相关病毒（rAAV）载体因其低免疫原性和长期基因表达潜力，已成为体内递送遗传物质的主要工具。从2012年欧洲药品管理局批准Glybera?，到2017年美国FDA批准Luxturna?，AAV基因疗法的临床应用版图不断扩大。然而，面对慢性病和更大患者群体的治疗需求，高剂量疗法往往需要超过10¹⁴载体基因组/患者，使得rAAV的大规模、高质量生产成为制约其广泛应用的关键瓶颈。

当前rAAV生产主要面临多重挑战：瞬时转染技术本身限制了工艺放大，稳定生产细胞系的开发又面临安全性和开发周期长的难题。更重要的是，作为生产主体的HEK293细胞并非天然为病毒载体生产而进化，其细胞内环境可能存在限制病毒复制的固有机制。能否像优化生物药生产细胞那样，通过细胞工程手段改造HEK293细胞，从而突破rAAV的生产瓶颈？

微小RNA（miRNA）作为基因表达的关键调控因子，以其能够同时调控多个靶基因和整个信号通路的独特优势，在细胞工程领域展现出巨大潜力。这些长约22个核苷酸的非编码RNA分子，通过结合目标mRNA诱导翻译抑制或降解，已成为优化治疗性蛋白生产的有效工具。那么，能否利用miRNA重编程HEK293细胞，解除其生产限制，从而提升rAAV产量？

发表在《New Biotechnology》上的这项研究给出了肯定答案。研究团队成功建立并实施了一个全基因组miRNA筛选平台，系统性地筛选了2428种人类miRNA模拟物，最终鉴定出多个能显著提高rAAV产量的先导miRNA，为rAAV生产的细胞工程优化提供了创新解决方案。

研究人员采用了几项关键技术方法：首先建立了三步筛选平台——Lipofectamine 3000介导的miRNA模拟物转染HEK293细胞，PEIpro?介导的rAAV质粒转染，以及基于Huh7细胞的功能性滴度测定。随后通过二级筛选验证初筛结果，并使用质粒为基础的miRNA表达系统在Ambr?15微型生物反应器系统中进行规模化验证。生物信息学分析则利用DIANA-miRPath和TargetScan等工具探索miRNA的作用机制。

3.1. 建立用于rAAV生产的多步骤miRNA筛选平台

研究人员首先优化了转染条件，比较了Lipofectamine 3000和DharmaFECT1两种转染试剂，最终选择Lipofectamine 3000进行100nM miRNA模拟物的转染，因其对细胞活力影响较小且能有效下调目标基因TWF1表达。随后建立的rAAV质粒转染系统显示，miR-1转染可提高GFP阳性活细胞数量。功能实验表明，使用分泌型胚胎碱性磷酸酶（SEAP）作为报告基因，能可靠地评估rAAV的功能滴度。

3.2. miRNA筛选平台的实施

平台验证显示两次独立实验结果高度一致，证明该筛选系统稳定可靠。整个筛选流程包括miRNA模拟物转染、rAAV质粒转染、细胞裂解和Huh7细胞转导，最终通过SEAP化学发光法测定功能性rAAV滴度。

3.3. 鉴定增强AAV产量的miRNA

全基因组筛选共评估2428种miRNA，其中144种（5.93%）使功能性rAAV滴度提高2倍以上，484种（19.93%）有轻度正面影响。二级筛选证实了约50%的初筛阳性结果，最终选出hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-135b-5p等6种先导miRNA进行深入验证。

3.4. 使用质粒基础表达验证增强型miRNA

为贴近工业生产实际，研究人员将miRNA克隆至pcDNA?6.2-GW/EmGFP-miR表达载体中，形成四拷贝串联体。在96孔板中的验证实验显示，hsa-miR-125a-5p和hsa-miR-519-5p能显著提高功能性rAAV滴度。

3.5. 通过Ambr?15微型生物反应器生产扩大验证增强型miRNA

在Ambr15系统中，所有6种先导miRNA均能提高功能性rAAV滴度，其中hsa-miR-125a-5p和hsa-miR-6857-3p达到统计学显著水平。重要的是，这些miRNA在提高产量的同时，对细胞活力和密度无显著负面影响，且多数不会损害rAAV的关键质量属性，如载体基因组/衣壳比例和包装杂质。

3.6. 分析增强型miRNA的潜在分子机制

生物信息学分析揭示，这些miRNA主要靶向抗病毒感知和信号通路。例如，hsa-miR-125a-5p和hsa-miR-135b-5p通过实验验证靶向G3BP1、DDX3X等病毒传感通路关键基因，而预测分析显示其他miRNA也可能调控MAVS、IQGAP1等因子。同时，这些miRNA还调控凋亡通路相关基因如BAX、CFLAR等，从而可能减轻细胞抗病毒反应和程序性死亡，为rAAV复制创造更有利的细胞内环境。

研究结论表明，通过全基因组miRNA筛选鉴定出的先导miRNA，特别是hsa-miR-125a-5p，能显著提高HEK293细胞中的rAAV产量，且不影响关键质量属性。这些miRNA主要通过调控病毒传感信号通路和凋亡通路发挥作用，减轻细胞对病毒载体的防御反应。这一发现不仅为rAAV生产提供了有效的细胞工程工具，也为理解生产细胞内的病毒-宿主相互作用提供了新视角。

该研究的重要意义在于，首次系统地将miRNA作为细胞工程工具应用于rAAV生产优化，建立了一个可扩展的筛选验证平台，为基因治疗载体的工业化生产提供了创新解决方案。随着基因治疗向更常见疾病和更大患者群体扩展，这种提高产量的策略将有助于降低治疗成本，提高药物可及性。未来通过稳定整合这些miRNA到生产细胞基因组中，有望进一步优化rAAV生产工艺，推动基因治疗惠及更多患者。