角膜感染铜绿假单胞菌的耐药基因与毒力因子表型与基因型分析及其临床意义

《The Ocular Surface》：Phenotypic and Genotypic Profiling of Antimicrobial Resistance Genes and Virulence Factors in Pseudomonas aeruginosa Isolates from Keratitis Patients

本研究针对全球日益严重的角膜铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）耐药性问题，通过全基因组测序和表型分析，系统解析了70株临床分离株的耐药基因谱、毒力因子和移动遗传元件特征。发现关键耐药基因（如blaPAO、blaOXA、aph(3′)-IIb等）广泛存在，且地理分布差异显著；印度株多药耐药（MDR）比例高，而庆大霉素仍保持较高敏感性。研究为角膜感染精准治疗和耐药机制深入理解提供了重要依据。

　　

角膜感染是全球范围内致盲的重要原因之一，而铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）作为主要病原体，因其天然耐药性和强大的环境适应能力，治疗尤为困难。近年来，多重耐药（MDR）和广泛耐药（XDR）菌株的不断出现，使临床治疗面临巨大挑战。世界卫生组织预测，到2050年，耐药菌感染可能导致每年数百万人死亡。铜绿假单胞菌角膜感染可导致严重的视力损害甚至失明，在某些地区，该菌引起的角膜溃疡占所有病例的8%至48%。更令人担忧的是，43%的分离株对多种抗菌药物耐药，被归类为MDR。近年来，由耐药铜绿假单胞菌引起的角膜感染暴发事件屡见不鲜，例如在美国的一次暴发导致4人死亡、4人摘除眼球和14人视力丧失。因此，深入了解铜绿假单胞菌的耐药机制和毒力因子，对于制定有效的治疗策略和防控措施至关重要。

为了系统揭示角膜感染铜绿假单胞菌的耐药和毒力特征，研究人员开展了一项综合性研究，相关成果发表在《The Ocular Surface》上。研究人员从NCBI数据库获取了70株来源于角膜样本的铜绿假单胞菌分离株的全基因组数据，并补充了来自澳大利亚和印度的临床分离株的表型药敏实验和生物膜形成能力数据。研究整合了生物信息学分析和表型实验，主要关键技术包括：全基因组测序及注释（使用Prokka）、泛基因组分析（使用Roary）、系统发育树构建、多位点序列分型（MLST）、耐药基因和毒力因子鉴定（分别使用CARD、ResFinder和VFDB数据库）、移动遗传元件（MGEs）和毒力岛分析（使用MobileElementFinder和IslandViewer），以及表型的肉汤微量稀释法测定最小抑菌浓度（MIC）和结晶紫法定量生物膜形成。

研究首先通过泛基因组分析揭示了角膜分离株的遗传多样性。70株菌共鉴定出23,336个基因，包括5,115个核心基因、1,578个shell基因和16,643个cloud基因。不同地理来源的菌株基因数量存在显著差异，澳大利亚、印度、美国和英国分离株分别鉴定出15,328、12,673、12,040和7,270个基因。与囊性纤维化（CF）和环境分离株相比，角膜分离株拥有更多的核心基因和cloud基因，表明其具有更丰富的基因库和更强的适应性。

在耐药基因分析方面，研究发现所有分离株均携带多种耐药基因，涉及抗生素外排、灭活和作用靶点改变等机制。最常见的获得性耐药基因包括β-内酰胺酶基因（bla_PAO和bla_OXA变体）、氨基糖苷类修饰酶基因（aph(3′)-IIb）、氯霉素耐药基因（catB7）和磷霉素耐药基因（fosA）。值得注意的是，对氟喹诺酮类耐药基因crpP的分析显示，角膜分离株的携带率显著高于CF分离株。表型药敏实验表明，大多数分离株对庆大霉素敏感，但对亚胺培南的耐药率高达68.9%。来自印度的分离株中，26.7%被鉴定为MDR菌株。

对移动遗传元件的分析发现，插入序列（如ISPa1、ISPa6、ISPa32）和转座子（如Tn4661、Tn6082、Tn5563）是角膜分离株中最常见的MGEs。这些元件可能通过基因组重排和水平基因转移，促进耐药性和毒力基因的传播。此外，在一些MDR菌株中鉴定出的毒力岛携带了与多重耐药蛋白、分泌系统和β-内酰胺酶活性相关的基因。

毒力因子分析显示，所有角膜分离株均携带一系列结构与分泌性毒力因子，包括IV型菌毛蛋白编码基因（ essential for adhesion, biofilm formation, and twitching motility）、III型分泌系统效应因子（如ExoS和ExoU）等。exoS和exoU的分布存在地理差异，印度分离株多携带exoU，而澳大利亚和美国分离株多携带exoS。生物膜形成实验表明，61.8%的分离株是强生物膜生产者，所有MDR菌株均被鉴定为强生物膜形成者。有趣的是，与运动性相关的基因（如fleI/flaG, fleP, flgL, fliC, fliD, fliS）在中等和弱生物膜生产者中更常见，且这些菌株对环丙沙星和庆大霉素的耐药率较低。

研究的结论部分强调，角膜感染的铜绿假单胞菌分离株携带丰富的耐药基因和毒力因子，具有进化成为MDR病原体的巨大潜力。虽然庆大霉素在体外仍表现出较好的活性，但氟喹诺酮类和碳青霉烯类的耐药问题令人担忧。研究揭示了不同地理区域菌株的耐药性和毒力特征差异，为地区性感染控制策略的制定提供了依据。对耐药基因和移动遗传元件的深入理解，有助于开发新的治疗方法和监测耐药性传播的动态变化。这项全面的基因型和表型分析为临床治疗角膜铜绿假单胞菌感染提供了重要的理论基础和数据支持。