AFM纳米压痕的粘弹性解析：预测软生物材料纳米级刚度的新方法

《Polymer Testing》：Viscoelastic interpretation of AFM nanoindentation for predicting nanoscale stiffness in soft biomaterials

本研究针对传统Hertz模型在原子力显微镜(AFM)纳米压痕中忽略材料粘弹性导致刚度测量失准的问题，提出了基于标准线性固体(SLS)和Kelvin-Voigt模型的粘弹性解析方法。通过对四种水凝胶（海藻酸盐、Cellink-RGD、GelMA、GelMA A）及生物组织（红细胞、透明带）的多速率压痕实验，成功分离弹性/粘性贡献，建立了压痕速率与表观杨氏模量的定量关系，为组织工程和再生医学中生物材料的精准力学表征提供了新范式。

　　

在组织工程和再生医学领域，生物材料的力学特性如同指挥细胞行为的"隐形手"，微妙的结构刚度变化足以决定细胞的生死存亡。然而传统宏观力学测试技术（如流变仪）在捕捉软材料（水凝胶、聚合物、生物组织）局部力学异质性时显得力不从心，就像用天文望远镜观察细胞般难以兼顾分辨率与真实性。原子力显微镜(AFM)纳米压痕技术虽能实现微纳尺度刚度映射，但沿用百年的Hertz接触模型将活体组织简化为纯弹性体的假设，恰似用标尺测量流动的河水——忽略了生物系统与生俱来的粘弹性本质。

为解决这一难题，来自意大利天主教圣心大学的研究团队在《Polymer Testing》发表创新性研究，通过建立粘弹性本构模型重新解读AFM纳米压痕数据，成功破解了速率依赖性力学响应的密码。研究团队采用标准线性固体(SLS)和Kelvin-Voigt两种模型对力-位移曲线进行深度解析，其中SLS模型能同时描述应力松弛和蠕变现象，而Voigt模型更侧重于捕捉蠕变效应。实验设计涵盖四种生物医学常用水凝胶（海藻酸盐、Cellink-RGD、GelMA、GelMA A）以及两类典型生物组织（健康/病变红细胞、猪/马透明带），通过系统改变压痕速率（0.5-15 μm/s）获取多维力学数据。

关键技术方法包括：采用Nanowizard II型AFM配备锥角40°的锥形探针进行纳米压痕测试，通过热校准确定弹簧常数（0.3 N/m），利用Hertz-Sneddon模型计算表观杨氏模量（设定泊松比0.33）；使用平行板流变仪（HAAKE MARS 60）进行振幅扫描和频率扫描测试，确定线性粘弹性区域(LVR)和动态模量；实验数据采用GraphPad Prism 9进行非线性拟合，生物样本队列来源为既往研究已公开数据。

纳米力学表征揭示水凝胶速率依赖性规律

通过分析不同压痕速率下的力-位移曲线，发现所有水凝胶均呈现典型的粘弹性特征：低速压痕时滞后环显著，表明粘性耗散占主导；随着速率提升，滞后现象减弱而表观刚度呈非线性增长。四种水凝胶的杨氏模量分布通过洛伦兹函数拟合显示良好均一性，其中Cellink-RGD和GelMA A的瞬时弹性模量分别达到海藻酸盐的17倍和34倍，归因于纳米纤维素增强效应和物理-化学交联协同作用。有效粘度分析进一步揭示强化网络结构伴随更高能量耗散能力，如GelMA A的有效粘度（2.10 Pa·s）显著高于纯GelMA（0.25 Pa·s）。

宏观流变学验证模型普适性

频率扫描实验显示所有水凝胶的储能模量(G′)和损耗模量(G″)均随频率增加而上升，其中海藻酸盐、Cellink-RGD和GelMA A的模量变化完美契合SLS模型预测。特别值得注意的是，GelMA水凝胶的相位角在0.1-10 Hz范围内保持稳定，表明其粘弹性行为区别于其他材料。宏观流变与纳米压痕数据虽在绝对值上存在尺度差异，但展现一致的速率强化趋势，交叉验证了粘弹性模型的可靠性。

生物组织力学特性解析

对红细胞的研究发现，病变细胞在2-15 μm/s速率区间的刚度显著高于健康细胞，但在更高速率下差异消失，反映病理状态对细胞膜光谱蛋白网络动态重组能力的损害。透明带力学分析则揭示物种特异性差异：猪透明带刚度（160 kPa）为马透明带（15 kPa）的10倍，但两者均呈现线性速率依赖关系，且粘性阻力占主导的力学特性可能有利于缓冲精子穿透时的机械冲击。

该研究开创性地将粘弹性理论融入AFM纳米压痕分析，建立了从表观模量中提取本征弹性的新范式。通过SLS模型公式E_app=E₀+E_t(1-e^{-η_effδ?/E_t})和Voigt模型公式E_app=E₀+η_eff(δ?/δ)，成功量化了水凝胶交联密度、生物组织病理状态与物种差异对力学行为的影响。这种方法不仅克服了传统Hertz模型对活体组织表征的局限性，更为设计仿生组织工程支架提供了多尺度力学设计准则。尽管模型在应对高度异质性样本时仍需完善，但其无需额外设备、直接解析标准AFM数据的优势，使其在药物筛选、病理诊断和生物材料开发等领域具有广阔应用前景。