基于MSH_02330基因SNP位点的双重实时荧光定量PCR新方法：精准区分鸡滑液囊支原体MS-H疫苗株与野毒株

《Poultry Science》：Enhancing Mycoplasma synoviae control: A novel quantitative real-time PCR approach to differentiate MS-H vaccine strain and field strains

本研究针对鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae, MS)防控中MS-H疫苗株与野毒株难以精准区分的难题，开发了一种基于MSH_02330基因131位点(A/G)单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)的新型双重TaqMan实时荧光定量PCR(Duplex qPCR)方法。该方法具有高灵敏度(检测限10 copies/μL)、高特异性和良好重复性(变异系数<2.5%)，可有效避免obg基因回复突变导致的假阳性，为疫苗免疫效果评估和MS净化提供了可靠技术支撑。

　　

鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae, MS)是严重危害家禽健康的重要病原体，可导致气囊炎、传染性滑膜炎和蛋壳顶端异常等多种疾病，造成巨大的经济损失。疫苗接种是控制MS感染的关键策略之一，其中温度敏感性活疫苗Vaxsafe?MS（MS-H株）在全球范围内广泛应用。然而，在实际防控工作中，准确区分疫苗株和田间野毒株对于评估疫苗免疫效果、制定后续防控方案至关重要。传统鉴别方法如细菌分离、基因测序、PCR-RFLP（聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性）和MLST（多位点序列分型）等操作繁琐、耗时长，难以满足大规模临床检测的需求。

更棘手的是，此前基于obg基因367位点SNP的鉴别方法面临着一个潜在风险：MS-H疫苗株在传代过程中可能发生obg基因的回复突变，导致其丧失温度敏感性，从而在检测中被误判为野毒株，出现假阳性结果。这种误判会严重影响对田间野毒株感染压力的准确评估，干扰防控决策。因此，开发一种不受obg基因回复突变干扰、能够稳定区分MS-H疫苗株和野毒株的新型检测方法，成为当前MS防控工作中亟待解决的技术瓶颈。

为了解决这一难题，发表在《Poultry Science》上的这项研究，旨在筛选出MS-H谱系特有的、更为稳定的SNP标记，并据此建立一种高精度、高通量的鉴别检测新方法。

研究人员首先对24个MS基因组进行了比对分析，从中筛选出18个MS-H谱系特有的SNP位点。通过测序验证，最终选定位于MSH_02330基因第131位的一个(A/G) SNP作为理想靶点。该位点不仅具有序列保守性，其碱基变化还引起了氨基酸性质的改变（甘氨酸→谷氨酸），增加了其作为稳定鉴别标记的可靠性。基于此SNP，研究团队成功建立了一种新型的双重TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR（Duplex qPCR）检测方法。

本研究的关键技术方法主要包括：1）基于基因组比对筛选MS-H谱系特异性SNP位点；2）针对选定的MSH_02330基因131位点(A/G) SNP，设计特异性TaqMan MGB探针和引物，建立双重qPCR检测体系；3）以重组质粒和临床样本（来自河北和江苏三省蛋鸡养殖场的143份腭裂拭子样本）为材料，系统评估所建立方法的灵敏度、特异性、重复性以及混合模板检测能力；4）通过与基于obg基因的qPCR方法以及vlhA基因测序分型结果进行对比，验证新方法的准确性。

The Duplex qPCR Assay Based on obg Gene

研究人员首先建立了基于obg基因367位点SNP的双重qPCR方法作为参照。该方法检测限达到10 copies/μL，扩增效率分别为97.99%（疫苗株）和94.45%（野毒株），相关系数(R2)均为0.999，显示出良好的线性关系。特异性试验表明，该方法能准确区分MS-H疫苗株（VIC通道信号）和MS野毒株（FAM通道信号），且与鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum, MG)无交叉反应。重复性试验显示，不同浓度质粒的Cq值变异系数(CV)均低于1.5%。然而，在混合模板检测中，当野毒株与疫苗株模板浓度差异较大时，高浓度模板会抑制低浓度模板的扩增。

Selection of the SNP

通过对候选SNP位点（14181、481287、498421、522899）进行扩增和测序，发现位点14181、522899和481287为MS-H谱系特有。其中，位点498421在MS-H疫苗株和山东/2017-2野毒株中均为C，不具备特异性。位点522899位于MSH_02330基因第131位，其SNP导致氨基酸由非极性变为酸性（Gly→Glu），可能影响蛋白二级结构，因此被选为建立新鉴别方法的靶点。

The Duplex qPCR Assay Based on MSH_02330 Gene

基于MSH_02330基因131位点SNP建立的新型双重qPCR方法，检测限同样为10 copies/μL。标准曲线显示，疫苗株和野毒株的扩增效率分别为99.44%和99.22%，R2均为0.999。该方法特异性强，能准确区分疫苗株和野毒株，且与MG无交叉反应。重复性试验中，Cq值的CV均低于2.5%。混合模板检测再次表明，存在显著浓度差异时，精确定量受限，但不影响定性判断优势菌株。

Comparison of Two Duplex qPCR Methods

对143份临床样本的检测结果进行对比分析发现，基于obg基因的方法检出32份野毒株阳性，54份疫苗株阳性；而基于MSH_02330基因的新方法检出20份野毒株阳性，59份疫苗株阳性。以vlhA基因测序分型结果为金标准（59份为C型，与MS-H疫苗株序列完全一致；20份为L型，对应野毒株），新方法的鉴别准确率达到100%，显著高于基于obg基因方法的93.67%。这证实了新方法能有效避免因obg基因回复突变而导致的假阳性问题。

该研究的结论与讨论部分强调，新建立的基于MSH_02330基因SNP的双重qPCR方法，成功克服了现有obg基因检测方法可能因回复突变而产生假阳性的缺陷。该方法操作简便、快速、灵敏度高、特异性强，适用于临床样本（纯培养物和腭裂拭子）的高通量检测。其核心SNP分型技术基于成熟的TaqMan MGB探针原理，具备开发成商业化试剂盒的潜力，为大规模监测MS-H疫苗株定植情况、评估野毒株感染压力、优化免疫程序提供了强有力的技术工具。特别是在obg基因回复突变率较高的地区，该方法可替代原有的obg基因检测方案，从而更准确地指导MS的防控与净化，对保障家禽健康、减少经济损失具有重要意义。研究人员表示，正在与国际实验室合作，收集不同地域、菌株、养殖场和免疫程序的样本，以进一步验证该方法的全球适用性。