综述：山茶花呈色分子基础与研究范式演进

《Scientia Horticulturae》：The molecular basis underlying phenotypic diversity in Camellia flower coloration and the evolution of research paradigms

本综述系统解析了山茶花（Camellia sp.）花色形成的分子基础与调控网络，重点阐述了类黄酮（尤其是花青素和黄酮醇）生物合成途径及其关键结构基因（CHS、CHI、F3H、DFR、ANS、UFGT等）和转录因子（MYB、bHLH、WD40组成的MBW复合物）的调控作用。文章深入探讨了影响花色的理化因素（如液泡pH、金属离子、内源激素、花瓣表皮细胞形态、温度和光照），并综述了杂交育种、芽变选育、分子标记辅助选择（MAS）和基因工程（如CRISPR/Cas9）等育种策略的最新进展，为通过定向遗传操纵和精准育种培育新花色山茶品种提供了重要理论参考。

　　

山茶花颜色分类

花色是山茶最重要的观赏性状，然而其颜色多样性有限。全球约2万个注册品种中，红色系占主导地位（≥95%），白色和复色品种有限，而黄花品种极为稀有珍贵。复色山茶主要表现为一树多色或单花多色（如条纹、斑点、镶边）。截至2024年12月，国际山茶登录中心数据显示，C. japonica品种以红、粉、白为主；C. sasanqua品种主要为红、粉、白，紫色罕见；C. reticulata品种绝大多数为红色（≥75%），缺乏黄、蓝等新色调。金花茶组（C. sect. Chrysantha）则呈现出完整的黄色色调，是培育黄花山茶最关键的遗传资源。

山茶花色素组成

花瓣颜色的变化主要由色素类型和相对浓度决定，包括类黄酮、类胡萝卜素、甜菜色素和叶绿素。山茶花以红色为主，类黄酮（尤其是花青素）是红色花瓣中的主要色素成分，而黄酮醇则主要在黄花山茶中检测到。类胡萝卜素通常赋予花瓣橙黄、橙红和鲜红色。在金花茶中，早期研究认为类黄酮和类胡萝卜素是主要色素，但近期研究表明黄酮醇是其黄色着色的主要呈色成分，而类胡萝卜素作为辅助色素主要存在于雄蕊中。叶绿素也在不同颜色的C. reticulata花瓣中检测到，且含量差异显著。

花青素

花青素是植物器官着色的关键次生代谢物，主要负责红、紫、蓝色。山茶花瓣中，花青素是主要的色素成分。红色至深红色的山茶花瓣显示出卓越的花青素浓度。无色花青素是花青素的前体，已在白色和红色山茶中检测到。代谢组学分析表明，差异化的花青素积累驱动了红色品种内的颜色变异。在山茶红色花瓣中，矢车菊素衍生物占主导地位，飞燕草素和天竺葵素衍生物较为罕见。矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（Cy3G）和矢车菊素-3-O-半乳糖苷（Cy3Ga）是普遍存在的红色发色团。飞燕草素衍生物主要存在于C. hongkongensis和C. sasanqua中。尽管在某些品种中检测到飞燕草素，但蓝色着色在山茶中仍然缺失。

类胡萝卜素

类胡萝卜素和类黄酮因其分布广泛且能产生花瓣鲜艳颜色而受到越来越多的关注。类胡萝卜素可以产生从鲜红、橙色到黄色的花色。对山茶花中类胡萝卜素的研究主要集中在金花茶。早期研究认为类黄酮和类胡萝卜素是金花茶的主要色素，但近期研究证实黄酮醇是金花茶黄色着色的主要呈色成分，而类胡萝卜素主要位于雄蕊中。此外，在其他山茶物种中也检测到类胡萝卜素，但其含量通常远低于类黄酮。

黄酮醇

类黄酮是植物界中最普遍存在的次生代谢物，其中黄酮醇是淡黄色和黄色着色的关键贡献者。黄花山茶品种稀有且具有园艺价值，具有重要的研究和美学意义。金花茶以其独特的金黄色花朵而闻名，是黄花山茶育种的宝贵遗传资源。早期研究将金花茶的黄色归因于类黄酮和类胡萝卜素，但新兴证据表明，黄酮醇——特别是槲皮素和山奈酚的糖苷——是其金黄色的主要呈色成分。槲皮素-3-O-葡萄糖苷（Qu3G）和槲皮素-3-O-鼠李糖苷（Qu3R）浓度的增加显著增强了黄色着色。

多种色素在山茶花呈色中的协同相互作用

广泛的研究证实，山茶物种的花色与类黄酮（包括黄酮醇、黄酮和花青素）的含量和组成密切相关。在红色山茶品种中，Cy3G、Cy3Ga和Pg3G浓度的变化主要驱动颜色分化。白色和黄色山茶花仍然含有微量的花青素，特别是飞燕草素变体。山奈酚及其糖苷对白色着色至关重要。黄色着色主要在金花茶中观察到，其机制存在争议。早期研究将其归因于类胡萝卜素和类黄酮，但随后的代谢组学分析确定黄酮醇——尤其是Qu3G和Qu7G——是主要的瓣瓣色素，而类胡萝卜素在花瓣中积累最少，主要存在于雄蕊中。总之，山茶花色是多种色素类别协同相互作用的结果，而不是单一化合物的结果。这些色素的积累和比例分布最终受代谢途径和转录调控网络的调控。

山茶花中类黄酮的生物合成

类黄酮是植物中一类重要的次生代谢物，具有衍生物多样性和复杂的生物合成途径。类黄酮的生物合成途径已基本阐明，主要分为三个阶段：

第一阶段：苯丙烷途径。苯丙氨酸通过苯丙氨酸解氨酶（PAL）转化为肉桂酸，进而生成对香豆酰辅酶A，与丙二酰辅酶A一起作为类黄酮生物合成的初始底物。

第二阶段：早期生物合成基因（EBGs）。查尔酮合成酶（CHS）催化生成查尔酮，查尔酮异构酶（CHI）将其异构化为柚皮素，黄烷酮3-羟化酶（F3H）催化生成二氢山奈酚（DHK），进而通过类黄酮3'-羟化酶（F3'H）或类黄酮3',5'-羟化酶（F3'5'H）生成二氢槲皮素（DHQ）或二氢杨梅素（DHM）。EBGs还包括黄酮合成酶（FNS）和黄酮醇合成酶（FLS）等，它们参与黄酮和黄酮醇合成的上游途径。

第三阶段：晚期生物合成基因（LBGs）。二氢黄酮醇（如DHK、DHQ、DHM）通过二氢黄酮醇4-还原酶（DFR）和花青素合成酶（ANS）转化为花青素，如矢车菊素（Cy）、飞燕草素（Dp）和天竺葵素（Pg）。这些花青素随后通过类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶（UFGT）糖基化，并进一步修饰形成各种花青素，储存于液泡中。

参与山茶花类黄酮生物合成的基因

花瓣的着色模式由类黄酮生物合成基因的表达水平决定。在山茶花中，先前的研究已经鉴定出多个与类黄酮生物合成相关的结构基因，并对其中一些基因进行了功能表征。这些结构基因被发现可促进红色山茶花瓣中类黄酮化合物，特别是花青素的积累。值得注意的是，DFR和ANS显著增强了红色山茶花瓣中的花青素积累。相反，抑制这些结构基因会抑制类黄酮合成。有趣的是，CjF3H、CjDFR和CjANS的表达水平在红色和白色山茶花瓣之间没有显著差异。此外，在一些山茶品种中，F3'5'H编码基因的表达与花瓣中飞燕草素（Dp）含量的变化相关。

在黄花金花茶中，CnCHS、CnCHI、CnF3H、CnF3'H、CnDFR、CnANS和CnUFGT等基因的表达与花瓣黄色度呈负相关，因为这些基因主要促进花青素和多酚的合成。金花茶中CnFLS的异源表达可增强黄酮醇积累，但未能产生明显的黄色着色。因此，需要未来的研究来加深对类黄酮生物合成及其调控机制的理解，特别是揭示金花茶花色形成的分子基础。

类黄酮生物合成中的关键基因影响山茶花色

黄酮醇和花青素通过苯丙烷途径合成，其中二氢黄酮醇通过DFR或FLS催化的不同酶促步骤转化为不同的代谢物。DFR主要促进花青素合成，导致花瓣红色着色，而FLS驱动黄酮醇合成，产生黄色着色。由于DFR和FLS共享共同底物，这些基因表现出竞争性相互作用并相互抑制转录。在山茶花中，粉色花中DFR的表达水平高于白色花；相反，白色花中FLS的表达水平高于粉色花。类似地，茶树FLS a/b/c在烟草中的异源表达增加了花瓣中山奈酚的积累，同时 drastically 降低了花青素水平。此外，在金花茶的发育过程中也观察到类似现象：FLS的高表达 coupled with DFR的极低表达导致花瓣中黄酮醇的积累，而花青素没有积累。

黄酮醇是金花茶黄花形成的主要色素。FLS在黄酮醇生物合成中起关键作用，并已被证明在拟南芥、菊花、牡丹等物种的花色决定中起作用。然而，单独在烟草中表达CnFLS1并未产生显著的黄色花色，表明FLS并非孤立起作用。在本氏烟转化实验中，发现只有当FLS、CHS和F3'H共表达时才会发生槲皮素-3-葡萄糖苷及相关化合物的合成；此外，UFGT的共表达显著增加了Qu3G的含量。这些不同的观点强调了山茶花色素生物合成的复杂性以及破译花色分子机制方面持续存在的挑战。

转录因子对类黄酮生物合成的调控

转录因子

除了结构基因，花青素生物合成还受到转录因子（TFs）的严格调控。研究最广泛的是MYB、bHLH和WD40蛋白，它们通常形成MYB-bHLH-WD40（MBW）复合物来激活或抑制生物合成基因的表达，从而调节花青素积累。研究表明，MYB和bHLH转录因子直接结合结构基因的启动子来调节其表达，而WD40蛋白通常作为支架稳定MBW复合物并参与多个生物过程。随着对花青素生物合成途径研究的深入，来自B-box、WRKY、bZIP等家族的转录因子也被证明参与花青素合成。

在植物中，MYB转录因子家族是植物代谢网络中最大和最重要的转录调节因子类别之一。其中，R2R3-MYB转录因子已被广泛报道在多种植物物种中调节花青素生物合成。在山茶物种中，研究主要集中在MYB转录因子上。例如，在C. japonica中鉴定出R2R3-MYB转录因子CjMYB114，它通过与CjbHLH1相互作用激活花青素结构基因DFR的启动子活性；CjMYB114的过表达增强了烟草中的花青素积累。类似地，在C. japonica中表征的R2R3-MYB转录因子CjMYB1在红色花品种中的表达水平高于粉色、淡黄色或白色品种。在茶树中，CsMYBPA1通过结合MBS顺式作用元件激活CsGSTU18，从而促进花青素生物合成。CsMYB113的过表达显著增加了多个组织中的花青素积累。CsMYB90的过表达导致转基因愈伤组织呈深紫色。CsMYB6A可激活类黄酮相关的结构基因，特别是CHS和3GT，从而调节转基因烟草叶片中的花青素积累。在金花茶中，CnMYB111主要催化类黄酮途径中DHQ的合成，促进多酚产生而不显著增强黄酮醇合成。CnMYB7结合CnCHI4启动子中的MBS顺式作用元件以促进金花茶中的类黄酮积累。CnMYB4在金花茶盛花期花朵中高表达，可能通过负反馈调节类黄酮生物合成，从而影响花色。

碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）转录因子是植物中仅次于MYB TFs的第二大转录因子家族。研究表明，bHLH TFs通过与MYB TFs相互作用来激活或抑制结构基因的表达，从而调节花青素积累。在C. japonica中鉴定出CjbHLH1，它与CjMYB114相互作用，强烈激活CjDFR启动子，从而促进山茶花瓣中的花青素生物合成。CsbHLH89不仅正向调节茶树中的花青素生物合成，还通过结合光信号因子CsHY5间接增强花青素积累。在金花茶中表征的CnbHLH79可能在花发育早期负向调节类黄酮生物合成。

WD40（WD重复）蛋白是一个广泛存在于真核生物中的家族，通常包含多个串联的WD结构域。在山茶物种中，对WD40的研究主要集中在茶树。例如，CsWD40与两个bHLH TFs（CsGL3和CsTT8）和两个MYB TFs（CsAN2和CsMYB5e）相互作用形成三元MBW复合物，增强烟草中的花青素积累。另一个由CsMYB5a、CsTT8和CsWD40组成的MBW复合物主要调节黄烷醇的生物合成，而由CsMYB6a、CsTT8和CsWD40组成的单独复合物则调节花青素合成。

RNA调控

mRNA的可变剪接（AS）也是茶中类黄酮代谢的重要调控方式。主要花青素生物合成基因中的AS导致紫茶中的花青素水平显著高于绿茶，表明其在茶花花青素积累的转录后调控中起作用。同样，microRNA156（miR156）已被报道通过靶向SQUAMOSA启动子结合蛋白样（SPL）家族在调节植物开花和花青素生物合成中发挥重要作用。在茶树中，Csn-miR156d通过抑制CsSPL1的表达来调节开花和花青素积累。此外，lncRNAs的动态表达影响参与次生代谢（包括类黄酮和萜类生物合成）的靶基因。然而，在表观遗传修饰方面，包括染色质重塑和组蛋白修饰，可能在茶的花青素生物合成中具有关键的调控作用，但这方面的探索较少。同样，DNA甲基化是建立基因型与表型之间核心联系的关键表观遗传修饰。

表观遗传调控

植物中花青素的生物合成受到表观遗传机制的调控，包括DNA甲基化、非编码RNA、组蛋白修饰和染色质重塑。研究发现，紫茶品种'紫娟'中CsAN1启动子的甲基化水平低于花青素含量低的绿茶品种。此外，嫩叶（紫色）的甲基化水平低于成熟叶（深绿色），表明CsAN1启动子的低甲基化直接增强了花青素结构基因（CsCHS、CsFLS、CsF3'H、CsDFR、CsLDOX1和CsUFGT）的表达。然而，专门针对山茶花色形成的表观遗传调控的研究仍然非常有限。因此，需要进一步的研究来全面阐明控制类黄酮生物合成的调控机制及其对山茶物种花色多样性的贡献。

影响山茶花色的因素

花色是评价花卉观赏价值和经济价值的关键指标。类黄酮作为影响花色形成的主要色素，其生物合成受到各种物理和化学因素的调控，包括液泡pH、金属离子、内源激素、花瓣表皮细胞形态、温度和光照条件。

pH

液泡是植物色素细胞中色素储存的主要场所。液泡腔理化性质的改变会破坏或改变储存色素的状态。在富含花青素的植物中，pH对颜色的影响尤为显著。例如，在Ipomoea tricolor中，色素细胞中液泡pH从6.6异常升高到7.7导致花色从红色变为蓝色。对250多个花瓣样品的测量显示液泡pH范围在2.5-7.5之间。红色花的表皮细胞pH通常低于蓝色花，衰老的红色花瓣常随着液泡pH升高而变成蓝色。在山茶花中：红色花品种通常表现出较低的细胞pH（例如C. reticulata中为3.6-4.0），而黄色花品种（如金花茶）则显示出接近中性或弱碱性的较高pH值。有报道称金花茶的液泡pH呈弱酸性（6.06-6.55），pH升高与黄色着色增强相关。弱酸性至中性环境可能有利于稳定黄色色素，促进其视觉呈现。

金属离子

金属离子对花色影响主要源于其与类黄酮及相关组分的螯合作用，可增强花色素的稳定性。在植物细胞中，金属离子能与花青素结合形成络合物，这种现象可用金属螯合理论解释。这些高度着色的金属-花青素络合物显著影响颜色呈现。在山茶中，关于金属离子在花色中作用的研究主要集中在金花茶上。研究表明，Al³⁺和Fe³⁺与金花茶花瓣中的色素形成深色络合物，产生增色效应。低浓度的Al³⁺、Fe³⁺和Ca²⁺可促进金花茶花瓣的黄色着色。此外，在C. japonica 'Sennen-fujimurasaki'的不同颜色花瓣中，Ca²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺或Zn²⁺含量无显著差异，但紫红色和紫色花瓣中的Al³⁺水平分别是红色花瓣的4-10倍和14-21倍。在C. azalea中，Co²⁺增强着色，而Fe²⁺、Fe³⁺和Pb²⁺会使色素不稳定。此外，Ca²⁺和Mg²⁺也调节山茶花瓣中花青素的稳定性。

内源激素

内源激素在调节植物开花中起关键作用，各种激素之间的相互作用影响花色素的积累。在Lonicera japonica中，脱落酸（ABA）水平升高可能激活类胡萝卜素合成相关基因，导致花瓣从白色变为黄色。在番茄中，外源施用油菜素内酯（BR）可增强类胡萝卜素积累。在山茶物种中，关于内源激素在花色中作用的研究相对有限。在C. japonica 'Joy Kendrick'中，ABA正向调节红色花瓣条纹中的花青素生物合成。在金花茶中，茉莉酸（JA）可能促进花瓣中的黄酮醇生物合成。外源茉莉酸甲酯（MeJA）处理增加了黄酮醇含量，包括槲皮素和杨梅素。

花瓣解剖结构

花色不仅由色素（如花青素、类胡萝卜素和叶绿素）的类型和含量决定，还受细胞形态，特别是表皮细胞形状和排列的影响。色素在不同花瓣区域的分布和积累变化可能进一步与解剖结构差异相关。色素通常位于表皮细胞中；花青素主要存在于上表皮层，而在颜色较深的花瓣中，也可能存在于栅栏组织和海绵组织细胞中。在山茶中，不同颜色类型的花瓣表皮细胞结构存在显著差异。对野生C. japonica单瓣和重瓣花的扫描电镜（SEM）分析显示，在最扩展区域，花瓣两面的表皮细胞平坦且具有波纹状纹理。尽管产生了形状变化，但重瓣品种的内花瓣表皮细胞与野生单瓣类型相似。对金花茶表皮层发育过程中色素沉积的研究揭示了表皮细胞大小/形状与不同发育阶段颜色形成之间的相关性。对C. japonica 'Sennen-fujimurasaki'红色、紫红色和紫色花瓣细胞形态的检查显示，紫红色和紫色花瓣的表皮细胞由红色和紫色花瓣混合组成，而红色花瓣则显示 uniformly 红色的表皮细胞。

温度和光照

温度是影响花瓣着色的另一个关键物理因素。研究表明，高温显著减少多种花卉（如菊花、百合、矮牵牛）的花青素积累。山茶花主要在冬季至春季开花。在低温条件下，它们可能积累花青素作为对环境胁迫的响应，这可以部分解释为何红色调花朵在山茶中占主导地位。例如，野生C. reticulata原产于云南、川西南和黔西海拔1500-2800米的阔叶林或混交林中，冬季开花。这种高海拔、低温环境可能促进花青素积累，导致其特有的红色花朵。迄今为止，尚无研究阐明温度如何调控山茶的花色形成。这些植物在低温条件下产生大而色彩鲜艳的花朵的能力，为未来研究提供了一个有前景且令人兴奋的途径。

光是影响花青素生物合成的关键环境因素。早期研究表明，光照诱导多种植物（如拟南芥、矮牵牛）的花青素积累。在菊花中，遮荫处理显著降低花青素水平，导致花朵几乎变白。相反，在C. reticulata中，使用遮光率为60-70%的遮阳网遮荫显著增加花瓣中的总花青素含量并增强花色。在金花茶中，高温诱导色素转化和紫外线辐射引发的聚合物形成，导致色素提取物吸光度增加。另一方面，低温和减少光照可稳定花瓣色素。

山茶花花色育种现状

山茶花作为重要的木本观赏植物，因其卓越的观赏价值日益受到国内外育种家的关注。丰富的花色多样性显著提升了山茶花的商业价值，满足了园林绿化、盆栽和切花的需求。同时，选育具有耐热性、抗病性和独特花色的品种以适应气候变化和满足市场需求，一直是山茶育种家的主要目标。育种家采用多种方法培育新颖、优良且独特的山茶品种，例如杂交育种、芽变选育、实生选种和分子育种。然而，由于分子资源有限，新山茶品种的培育仍主要依赖杂交育种和芽变选育。值得注意的是，现有栽培品种中有很大一部分来源于自然杂交群体的选育，这一现象在C. reticulata的种质创新中尤为明显。尽管如此，与分子育种相比，杂交育种和芽变选育的结果不可预测且难以控制。因此，利用分子育种技术培育具有理想花部性状的新颖、优良、独特的山茶品种是育种家的首要任务。

杂交育种

山茶属拥有丰富的野生物种，是杂交育种的宝贵资源。杂交育种包括自然杂交和人工杂交两种途径。自然杂交是山茶育种的传统方法；然而，它耗时且结果难以预测。目前，超过80%的山茶品种是通过杂交育种培育的。据统计，用于山茶种间杂交的野生山茶亲本中，C. azalea亲本约占68%，C. reticulata及其杂交亲本约占16%，非C. reticulata亲本占11%，C. sasanqua亲本占3%，其他亲本占2%。C. azalea因其近乎全年开花和强适应性而受到重视，而黄花山茶（C. sect. Chrysantha）是培育黄花品种的珍贵遗传资源，为山茶育种提供了优良材料。育种家和爱好者利用这些作为亲本材料进行杂交研究，培育出了著名的杂交品种，如‘金背丹心’、‘星黄’、‘正黄旗’、‘黄旋绿’和‘新世纪’。然而，数十年的