腺病毒载体表达肠道病毒样颗粒疫苗通过激活恒定自然杀伤T细胞交叉预防柯萨奇病毒A10感染的作用与机制研究

《Vaccine: X》：Natural killer T cells play a significant role in preventing Coxsackievirus A10 infection through an adeno-based vaccine expressing enterovirus-like particles

本研究针对柯萨奇病毒A10（CVA10）引起的全球性手足口病（HFMD）缺乏有效疫苗的难题，开发了一种基于腺病毒载体表达EV-A71病毒样颗粒（AdVLP）的多价疫苗。研究利用hSCARB2转基因小鼠模型，证实AdVLP免疫不仅能诱导缺乏中和活性但具有病毒结合能力的抗体，还可显著激活iNKT细胞，通过抗体依赖性细胞毒性（ADCC）和补体依赖性细胞毒性（CDCC）机制，有效清除CVA10感染，实现交叉保护。该研究为开发针对多种肠道病毒的广谱疫苗提供了新策略。

　　

在全球范围内，手足口病（Hand, Foot, and Mouth Disease, HFMD）一直是困扰婴幼儿健康的重要公共卫生问题。传统上，肠道病毒71型（Enterovirus A71, EV-A71）和柯萨奇病毒A组16型（Coxsackievirus A16, CVA16）被认为是主要的致病元凶。然而，近年来，柯萨奇病毒A10（Coxsackievirus A10, CVA10）相关的HFMD疫情频发，其致病严重性日益凸显，但由于缺乏特异性的疫苗或抗病毒药物，由CVA10引发的HFMD构成了严峻的挑战。

面对这一难题，研究人员将目光投向了一种创新的疫苗策略——多价疫苗。理想的疫苗不仅需要对目标病毒有效，最好还能对相近的病毒株提供“一石多鸟”式的交叉保护。此前，研究团队成功开发了一种基于复制缺陷型5型腺病毒（Adenovirus 5, Ad5）的疫苗，该疫苗能够表达EV-A71的结构蛋白P1和非结构蛋白3CD，从而在体内组装成病毒样颗粒（Virus-Like Particle, VLP），这种疫苗被命名为AdVLP。前期研究已证明AdVLP对EV-A71和CVA16均能提供良好的保护。那么，一个关键的科学问题随之而来：这种基于EV-A71设计的AdVLP疫苗，是否也能有效防御CVA10的感染？其背后的免疫保护机制又是怎样的？为了回答这些问题，研究人员开展了一系列深入的实验。

本研究的实验模型选用了表达人清道夫受体B类2型（human Scavenger Receptor Class B Member 2, hSCARB2）的转基因小鼠（hSCARB2-Tg mice）。hSCARB2是EV-A71和CVA16等多种肠道病毒的功能性受体，本研究也证实其支持CVA10的感染。该模型小鼠在感染后可模拟人类疾病的部分特征，包括严重的神经系统症状甚至死亡，是评估抗肠道病毒药物和疫苗效力的理想工具。

为了开展研究，研究人员主要应用了几项关键技术：首先，利用分子克隆技术构建并生产了重组腺病毒疫苗AdVLP以及作为空载体对照的AdLacZ；其次，建立了hSCARB2-Tg小鼠的CVA10攻毒模型，用于在体评估疫苗的保护效果；第三，通过酶联免疫吸附试验（ELISA）和病毒空斑减少中和试验分别检测血清中CVA10结合抗体和中和抗体的水平；第四，采用酶联免疫斑点试验（ELISPOT）分析疫苗免疫后脾淋巴细胞在特定病毒抗原刺激下分泌干扰素-γ（IFN-γ）和白介素-4（IL-4）的情况，以评估细胞免疫应答；第五，通过流式细胞术（Flow Cytometry）对免疫后小鼠脾脏中的各类免疫细胞亚群（如iNKT细胞、B细胞、T细胞亚群）进行精确计数和分析；最后，设计了巧妙的过继免疫转移实验，即将免疫小鼠的血清或脾淋巴细胞被动转移给幼稚小鼠，再观察其对CVA10攻击的抵抗能力，从而直接验证体液免疫或细胞免疫的保护作用。

3.1. AdVLP预防hSCARB2-Tg小鼠感染CVA10后的病理反应

研究人员首先在新生hSCARB2-Tg小鼠中评估了AdVLP疫苗的直接保护效果。小鼠在出生后第2天和第8天分别接种AdVLP、对照载体AdLacZ、福尔马林灭活的CVA10疫苗（FI-CVA10）或PBS，然后在第12天用致死剂量的CVA10进行攻击。结果发现，与AdLacZ或PBS对照组小鼠出现高疾病评分、严重体重下降和100%死亡率相比，AdVLP免疫显著降低了疾病严重程度，小鼠仅出现轻微体重下降并全部存活，其保护效果与FI-CVA10疫苗相当。进一步通过实时逆转录PCR（RT-PCR）检测攻毒后第3天小鼠组织中的病毒载量，发现AdVLP免疫能显著降低大脑和脊髓中的CVA10病毒量，但在肌肉组织中病毒载量下降不明显。一个有趣的发现是，空载体AdLacZ免疫也显示出一定的非特异性保护作用，提示腺病毒载体本身可能激活了先天免疫。

3.2. AdVLP诱导的CVA10结合抗体可预防CVA10感染

为了探究AdVLP保护作用中的体液免疫成分，研究人员进行了血清被动转移实验。将免疫后成年小鼠的血清转移至新生小鼠体内，再进行CVA10攻击。ELISA检测显示，AdVLP免疫血清能产生高水平的CVA10结合抗体，但其缺乏中和活性；而FI-CVA10免疫血清则同时具有高滴度的结合抗体和中和抗体。重要的是，转移AdVLP免疫血清（尤其是免疫后8周收集的血清）能有效保护新生小鼠，减轻疾病并提高存活率。当将AdVLP免疫血清进行热灭活（56°C 30分钟）以破坏补体活性后，其保护效果出现下降，这表明AdVLP诱导的保护性抗体可能部分通过激活补体系统（Complement System）发挥功能，即补体依赖性细胞毒性（CDCC）机制。

3.3. AdVLP免疫的脾淋巴细胞赋予Tg小鼠抵抗CVA10感染的能力

接下来，研究转向细胞免疫。ELISPOT实验表明，AdVLP和FI-CVA10免疫小鼠的脾淋巴细胞在受到多种肠道病毒（CVA10, CVA6, EV-D68, EV-A71）的紫外灭活颗粒刺激后，均能分泌IFN-γ和IL-4，表明疫苗诱导了交叉反应的细胞免疫。但两者免疫偏倚不同：AdVLP更倾向于诱导Th1型反应（IFN-γ分泌更多），而FI-CVA10更偏向Th2型反应（IL-4分泌更多）。更为关键的过继转移实验显示，将AdVLP免疫小鼠的脾淋巴细胞转移给新生小鼠，能提供100%的保护率，使其完全抵抗CVA10的攻击；而转移FI-CVA10免疫的淋巴细胞则无任何保护作用。这清晰地表明，AdVLP所激发的细胞免疫在对抗CVA10感染中扮演了至关重要的角色。

3.4. AdVLP增强的淋巴细胞效应物诱导针对CVA10感染的保护

为了进一步精确定位是哪种淋巴细胞亚群介导了保护，研究人员使用抗体偶联磁珠负选试剂盒将AdVLP免疫小鼠的脾淋巴细胞分离为pan-T细胞（主要为传统T细胞）和非pan-T细胞（包含B细胞、NK细胞、NKT细胞、树突状细胞等）。令人惊讶的是，无论是pan-T细胞还是非pan-T细胞，过继转移后都能对CVA10攻击提供部分保护，尽管保护率不及完整的脾淋巴细胞。这提示保护性效应细胞可能存在于多个淋巴细胞亚群中。

3.5. AdVLP诱导iNKT细胞介导的免疫以抵抗CVA10感染

最后的谜题指向了具体的效应细胞类型。流式细胞术分析发现，与PBS、AdLacZ或FI-CVA10免疫组相比，AdVLP免疫能特异性地显著增加脾脏中CD45⁺CD3⁺CD1d⁺的iNKT细胞、CD45⁺CD19⁺的B细胞以及CD45⁺CD3⁺CD8⁺的细胞毒性T细胞（Cytotoxic T cells, Tc）的比例。为了直接验证iNKT细胞的功能，研究者在过继转移前，使用CD1d特异性抗体处理AdVLP免疫 donor 小鼠，以耗竭其脾淋巴细胞中的iNKT细胞。结果非常显著：转移经iNKT细胞耗竭的AdVLP免疫淋巴细胞后，受体小鼠完全丧失了抵抗CVA10的能力，疾病严重程度加剧，全部死亡。这确凿地证明，iNKT细胞的激活是AdVLP提供交叉保护的核心机制。

结论与讨论

本研究系统阐明了腺病毒载体疫苗AdVLP通过激活一种独特的免疫细胞——恒定自然杀伤T细胞（iNKT细胞），来实现对CVA10感染的有效交叉保护。其保护机制是双重的：一方面，AdVLP诱导产生针对肠道病毒结构蛋白（VP1-VP4）和非结构蛋白（如3C, 3D）的交叉结合抗体；另一方面，它强力激活了iNKT细胞。这些抗体可以像“桥梁”一样，一端（Fab段）结合在CVA10感染的细胞表面病毒抗原上，另一端（Fc段）则与iNKT细胞表面的Fcγ受体（如CD16）或通过补体C3与补体受体（Complement Receptor, CR）结合，从而介导iNKT细胞对感染细胞进行杀伤，即抗体依赖性细胞毒性（ADCC）和补体依赖性细胞毒性（CDCC）机制。

这项研究的发现具有重要的科学意义和转化价值。首先，它揭示了基于腺病毒载体的VLP疫苗在诱导广泛、高效的细胞免疫，特别是非传统T细胞免疫方面的独特优势。其次，它强调了在应对容易发生抗原变异的病毒（如肠道病毒）时，诱导强大的细胞免疫，尤其是针对保守抗原的细胞免疫，可能比单纯依赖中和抗体更为可靠和持久。这为开发新一代针对多种血清型肠道病毒的广谱多价疫苗提供了坚实的理论依据和可行的技术路径。该论文发表于《Vaccine: X》期刊，为全球HFMD的防控策略贡献了重要的中国智慧。