CLDN18.2靶向CAR-T细胞的脱靶毒性机制与逻辑门控安全策略的临床前研究

《Nature Communications》：On-target off-tumor toxicity of claudin18.2-directed CAR-T cells in preclinical models

本研究针对CLDN18.2靶向CAR-T疗法在胃癌治疗中出现的胃黏膜脱靶毒性问题，通过构建人源化小鼠模型，系统验证了毒性独立于CAR结构设计、共刺激域及肿瘤模型，并首次应用布尔逻辑“AND门”技术（LINK CAR）成功实现毒性抑制与抗肿瘤活性的平衡。该模型为实体瘤CAR-T疗法的安全性优化提供了关键平台，对推动临床转化具有重要意义。

　　

胃癌是全球范围内最具致命性的恶性肿瘤之一，尽管免疫检查点抑制剂和HER2靶向疗法为部分患者带来希望，但多数患者仍面临治疗选择有限、预后差的困境。近年来，嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法在血液肿瘤中取得突破性进展，却在实体瘤领域举步维艰。其中，紧密连接蛋白18.2（Claudin18.2, CLDN18.2）因其在胃癌和胰腺癌中的高表达特性，成为备受关注的新靶点。然而，早期临床试验显示，CLDN18.2靶向CAR-T疗法虽展现出抗肿瘤潜力，却伴随严重的胃黏膜损伤等脱靶毒性，凸显了安全性评估模型的缺失与改进策略的紧迫性。

发表于《Nature Communications》的这项研究，旨在构建一种能模拟临床脱靶毒性的小鼠模型，并探索解决这一难题的有效策略。研究人员首先通过慢病毒载体构建了两种CLDN18.2 CAR-T细胞（分别基于Zolbetuximab和hu8e5单链抗体），并在体外验证其对人胃癌细胞系（GSU、NUGC-4）的高效杀伤活性。随后，他们在免疫缺陷小鼠（NSG）中建立异种移植瘤模型，系统评估CAR-T的体内毒性。结果显示，无论使用何种CAR结构、共刺激域（CD28或4-1BB）或肿瘤模型，CLDN18.2 CAR-T均导致小鼠体重急剧下降、胃黏膜广泛浸润性损伤甚至死亡，且毒性严重程度与CAR-T在血液中的扩增水平正相关。值得注意的是，在无瘤小鼠中同样观察到类似毒性，证实其脱靶效应源于对正常胃黏膜CLDN18.2的识别，而非肿瘤依赖性激活。

为突破这一瓶颈，团队引入布尔逻辑“AND门”技术（LINK CAR），将CLDN18.2与间皮素（Mesothelin）作为双靶点，要求T细胞仅在被两种抗原同时激活时才发起攻击。体外实验表明，LINK CAR-T能特异性杀伤双阳性肿瘤细胞，而对单阳性正常细胞无反应；体内实验进一步证实，该策略在完全抑制胃毒性的同时，仍能维持显著的抗肿瘤效果，且部分小鼠实现长期无瘤生存。

关键技术方法包括：利用慢病毒载体构建多种CAR-T变体；通过流式细胞术、免疫组化（IHC）和实时细胞杀伤实验评估功能；建立NSG及B2mKO小鼠肿瘤模型以延长观察期；采用患者基因表达数据库（GTEx、TCGA）分析靶点共表达模式。

研究结果

1. CLDN18.2 CAR-T细胞在小鼠中引发致死性胃黏膜损伤

通过皮下移植GSU胃癌细胞的NSG小鼠模型，注射Zolbe-CD28z或hu8e5-CD28z CAR-T细胞后，肿瘤迅速消退，但所有小鼠出现体重下降>20%及胃黏膜上皮脱落。免疫组化显示CAR-T细胞大量浸润胃组织，伴随CLDN18.2表达缺失，证实毒性为靶向健康胃黏膜所致。

2. 脱靶毒性独立于共刺激域、CAR骨架和肿瘤模型

通过对比不同供体来源、scFv取向（VH-VL/VL-VH）、跨膜域（CD8/CD28）及共刺激域（CD28/4-1BB）的CAR-T细胞，发现毒性现象高度一致。仅在个别供体（如Donor 2）中未见毒性，提示个体差异可能影响CAR-T扩增能力。

3. CLDN18.2 CAR-T细胞存在狭窄的治疗窗口

剂量实验表明，3×10⁴细胞剂量无效，3×10⁵可部分抑制肿瘤但仍有毒性，而3×10⁶导致致命毒性。在低抗原密度模型（NUGC-4）中，中等剂量疗效有限，提示靶点表达水平直接影响疗效窗口。

4. 靶向CLDN18.2与间皮素的AND门策略克服毒性

LINK CAR-T细胞在体外仅激活于CLDN18.2⁺Mesothelin⁺的GSU细胞，而对单抗原敲除细胞无反应。体内实验中，其完全避免胃损伤，且在三成小鼠中实现长期肿瘤清除，尽管扩增水平低于传统CAR-T。

结论与讨论

本研究首次建立了一种能精准模拟CLDN18.2 CAR-T临床毒性的小鼠模型，揭示了脱靶效应的普遍性与严重性，并成功通过逻辑门控技术实现安全性的显著提升。尽管小鼠模型可能高估人类实际毒性风险（如部分胃癌患者已切除胃部），但其为核心问题——靶向正常组织——提供了不可替代的研究平台。LINK CAR策略的局限性在于依赖双抗原共表达，未来需拓展至更广泛靶点组合。此外，毒性程度与CAR-T扩增的关联提示，临床中监测细胞动力学可能成为毒性预警的关键指标。这项工作不仅为CLDN18.2靶向疗法的优化铺平道路，更为实体瘤CAR-T领域的安全策略开发提供了范式转换级的借鉴价值。