基因组拷贝数变异通过调控凋亡逃逸驱动免疫检查点抑制剂获得性耐药

《Immunity》：Genomic copy-number variants drive apoptotic evasion underlying acquired resistance to immune checkpoint inhibitors

本研究针对免疫检查点抑制剂(ICI)治疗后复发的黑色素瘤，通过整合临床样本基因组学与功能实验发现，获得性耐药(AR)与促凋亡基因缺失/抗凋亡基因扩增的拷贝数变异(CNV)密切相关。研究人员建立了体外/体内AR模型，证实CNV通过降低线粒体凋亡阈值导致耐药，而恢复凋亡信号可重新敏感化肿瘤细胞。该研究为克服ICI耐药提供了新靶点，发表于《Immunity》2025。

　　

免疫检查点抑制剂(ICI)的出现彻底改变了晚期黑色素瘤的治疗格局，然而获得性耐药(AR)仍是临床面临的重要挑战。约20%-60%的初始应答患者最终会出现疾病进展，但其分子机制尚未完全阐明。传统研究多聚焦于点突变驱动的耐药机制，而对拷贝数变异(CNV)在AR演化中的作用认识不足。

为了系统解析ICI获得性耐药的基因组基础，加州大学洛杉矶分校Roger S. Lo团队对17例配对基线/进展期黑色素瘤样本进行全外显子测序(WES)，结合23项CRISPR-Cas9筛选数据，发现进展期肿瘤特异性CNV显著富集于凋亡相关通路。通过建立人源化T细胞共培养模型和小鼠体内ICI治疗模型，研究人员证实CNV驱动的凋亡阈值升高是AR的核心机制。单细胞全基因组测序(scWGS)进一步揭示了耐药亚克隆中预存性和新生性CNV的演化规律。该研究为通过调控凋亡通路逆转ICI耐药提供了理论依据，成果发表于《Immunity》杂志。

关键技术方法包括：1）临床队列的配对样本全外显子/全基因组测序分析；2）基于HLA/抗原特异性T细胞的体外共培养模型构建；3）小鼠YUMM1.7ER syngeneic模型的体内ICI耐药演化研究；4）单细胞全基因组测序解析亚克隆CNV演化；5）BH3 profiling技术量化线粒体凋亡阈值；6）免疫荧光验证关键蛋白表达。

结果

复发性疾病进展特异性CNV减弱肿瘤细胞死亡

通过对17例患者匹配的基线/进展期肿瘤WES分析，发现30%的进展期肿瘤携带CN10/12特征性局灶性杂合缺失(LOH)，提示单拷贝缺失可能驱动ICI复发。进展期特异性缺失/扩增基因显著富集于细胞死亡调控通路，与CRISPR筛选确定的抵抗/敏感基因存在108个缺失-抵抗基因和90个扩增-敏感基因重叠，包括TNFRSF1A、BAX等促凋亡基因和BIRC2、MCL1等抗凋亡基因。功能实验证实，敲低单个促凋亡基因（如BAX或FAS）即可减弱黑色素瘤细胞对T细胞的敏感性。

ICI选择驱动基因的共突变

共现性分析显示进展期肿瘤频繁出现促凋亡基因共缺失（如DFFB和CASP9）和抗凋亡基因共扩增（如BIRC2和STAT3）。系统进化分析表明所有病例均遵循分支演化模式，其中12例进展期肿瘤携带2-10个促凋亡基因共缺失，6例携带≥2个抗凋亡基因共扩增，5例同时存在抗凋亡基因扩增和促凋亡基因缺失。免疫荧光验证了CASP9/DFFB等共缺失基因的蛋白表达下调。

AR模型重现疾病进展特异性凋亡基因CNV

通过8轮T细胞筛选获得5个M486获得性耐药株，全基因组测序(WGS)显示其共享TNFRSF1A、BAD、TP53等促凋亡基因单拷贝缺失，重现了临床病例中的共缺失模式。小鼠YUMM1.7ER模型经ICI长期处理后产生的耐药肿瘤同样显示Bcl3/Bcl2l2扩增和Bad/Fas缺失等CNV特征。Western blot验证CNV导致相应蛋白表达改变。

耐药通过亚克隆私有性和预存性CNV演化

单细胞WGS解析显示，M486耐药亚克隆携带IFNGR1、B2M等基因的私有性缺失和IKBKG等基因的私有性扩增。值得注意的是，部分耐药相关CNV（如BAD缺失）在亲代细胞中已存在低频率预存。小鼠模型和临床病例Pt18的scWGS进一步证实了这种"预存-选择-扩增"的演化模式，其中复发肿瘤亚克隆携带MCL1扩增和BAD缺失等凋亡相关CNV。

恢复基因剂量重敏化AR细胞至T细胞共培养

在M486耐药株中过表达缺失的促凋亡基因（P53、BAD、TNFR1），单基因过表达部分恢复T细胞敏感性，双基因过表达达到部分至完全恢复，三基因过表达则显著超过亲代细胞敏感性。凋亡检测证实AR细胞线粒体细胞色素c释放能力受损，而过表达促凋亡基因可恢复其凋亡应答。

恢复凋亡 priming 重敏化AR肿瘤至ICI治疗

小鼠YUMM1.7ER耐药株过表达Bad+Fas后，BH3 profiling显示其线粒体凋亡阈值降低。体内实验证实，过表达Bad+Fas或联合使用BCL-2抑制剂venetoclax均可恢复ICI疗效。TUNEL和cleaved caspase-3染色显示，联合治疗能有效诱导耐药肿瘤细胞凋亡。

增强ICI持续存在细胞中的凋亡 priming 预防肿瘤复发

在ICI治疗产生应答后，持续联合venetoclax可显著降低复发率（从约30%降至最低），而单用venetoclax反而增加复发风险。这一策略为临床预防ICI耐药复发提供了潜在干预方案。

结论与讨论

本研究通过多组学整合分析揭示了CNV驱动ICI获得性耐药的新范式：黑色素瘤通过累积促凋亡基因单拷贝缺失和抗凋亡基因扩增，逐步提高凋亡阈值，从而逃避T细胞杀伤。这种"死亡由千刀万剐"的演化模式解释了为何需要多基因协同改变才能产生显著耐药表型。

单细胞基因组学证实了耐药演化的异质性，既有预存CNV亚克隆的选择性扩增，也有新生CNV的独立演化。值得注意的是，adjuvant ICI治疗后的复发肿瘤表现出与晚期疾病相似的CNV模式，提示这种耐药机制具有普适性。

从治疗角度，研究证实通过BH3 mimetic药物降低凋亡阈值可有效预防和治疗ICI耐药。特别是治疗早期在免疫应答基础上联合凋亡调控剂，可能通过消除潜在耐药亚克隆阻止复发演化。该策略突破了传统针对单一通路的思路，为克服ICI耐药提供了新方向。

研究局限性包括缺乏转录组数据验证、模型系统未能涵盖所有免疫细胞类型等。未来需要扩大样本量并探索CNV产生的根本机制。总之，该研究确立了凋亡阈值调控作为逆转ICI耐药的关键靶点，为联合免疫治疗提供了新思路。