级联靶向pH/ROS微针通过巨噬细胞代谢免疫重编程促进糖尿病创面无疤愈合

《SCIENCE ADVANCES》：Cascade-targeting pH/ROS microneedles promote scarless diabetic wound healing by macrophage metaboimmune reprogramming

本文推荐一种新型级联靶向微针系统（EM/Man MNs），其通过甘露糖修饰的纳米颗粒（EM/Man NPs）精准靶向巨噬细胞线粒体，激活AMPK/SIRT1/PGC-1α轴，促进线粒体生物发生和氧化磷酸化（OXPHOS），重编程巨噬细胞为抗炎M2表型，有效清除ROS、恢复ATP生成、促进血管新生和胶原沉积，同时抑制IL-17和PI3K-Akt通路以减少瘢痕形成，为糖尿病慢性创面治疗提供了代谢免疫调控新策略。

　　

糖尿病慢性创面是困扰全球医疗系统的重大难题，其典型特征包括高血糖、细菌感染和持续性炎症，导致创面迁延不愈。即便经过长期治疗，紊乱的免疫微环境仍可导致病理性瘢痕（如增生性瘢痕）的形成，给患者带来巨大痛苦和经济负担。免疫调节功能障碍和活性氧（ROS）水平升高是导致糖尿病创面延迟愈合或不愈合的关键因素。近年来，研究逐渐揭示线粒体在免疫调节和氧化还原平衡中的核心作用。巨噬细胞从M1（促炎）向M2（抗炎）表型的极化被认为是驱动炎症期向愈合增殖期转变的关键因素。然而，在糖尿病创面中，巨噬细胞向M2表型的极化受损，导致促炎M1巨噬细胞持续积聚，从而加剧氧化应激并延续慢性炎症反应。越来越多的研究表明，线粒体代谢在重编程巨噬细胞极化状态中起关键作用，其中M1巨噬细胞主要利用糖酵解，而M2巨噬细胞主要依赖氧化磷酸化（OXPHOS）。高糖条件导致线粒体功能障碍，特别是影响呼吸链复合物，驱动ROS的过量产生，由此产生的氧化应激损害细胞和组织完整性，严重损害创面愈合过程。

针对这一难题，发表在《SCIENCE ADVANCES》上的研究报道了一种具有级联靶向功能的可分离核壳微针贴片（EM/Man MNs），该微针能够精准调控巨噬细胞线粒体代谢，重编程巨噬细胞免疫功能，从而促进糖尿病慢性创面愈合并抑制瘢痕形成。

研究人员综合运用了纳米材料合成与表征（如扫描电镜、透射电镜、X射线光电子能谱、傅里叶变换红外光谱、动态光散射等技术验证纳米颗粒特性）、可分离核壳微针的制备与性能评估（包括机械强度、皮肤穿透性、ROS响应性药物释放）、体外细胞模型（巨噬细胞线粒体靶向与摄取、线粒体功能检测、代谢表型分析、巨噬细胞极化、血管生成实验）、体内动物模型（链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠慢性感染创面模型和兔耳增生性瘢痕模型）以及转录组测序（RNA-seq）与生物信息学分析（基因本体论GO、京都基因与基因组百科全书KEGG、基因集富集分析GSEA）等关键技术方法。动物实验均遵循美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南，并获南昌大学研究伦理委员会批准。

代谢异常介导糖尿病创面持续性炎症的发生

通过创建糖尿病小鼠背部感染创面模型，研究人员发现感染组创面愈合显著慢于未感染组，胶原沉积少且纤维排列紊乱。转录组测序分析表明，细菌感染不仅上调了IL-17、TNF-α等炎症信号通路，还表现出更高的糖酵解水平和更低的OXPHOS水平。免疫荧光分析证实感染组ROS水平显著升高，M1巨噬细胞标志物iNOS信号增强而M2标志物CD206信号减弱，表明细菌感染可能通过影响细胞线粒体能量代谢使巨噬细胞处于促炎状态。

EM/Man NPs的合成与表征

研究通过一锅法反应将表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）和二甲双胍组装成纳米颗粒（EM NPs），随后用甘露聚糖进行表面修饰，合成了具有核壳结构的多功能纳米颗粒（EM/Man NPs）。表征结果显示NPs呈均匀球形，具有明显的核壳结构，成功引入了甘露糖的特征峰，具有良好的稳定性和生物相容性。

NPs靶向巨噬细胞线粒体的能力

体外实验表明，与EM NPs相比，EM/Man NPs被巨噬细胞摄取的效率显著提高（约2.5倍），并且内化的NPs主要定位于线粒体周围，展现了其对巨噬细胞内线粒体的级联靶向能力。生物透射电镜进一步证实了EM/Man NPs与巨噬细胞线粒体的密切接触。

可分离核壳微针贴片的制备与表征

成功制备了以季铵盐壳聚糖（QACS）为壳、ROS可降解的聚乙烯醇（PVA-TS-PBA）为核的可分离核壳微针贴片（EM/Man MNs）。该微针阵列排列整齐（10×10），针高600 μm，基底直径200 μm，机械强度足以刺穿皮肤。共聚焦荧光显微镜三维成像证实了其核壳结构。微针在富含H₂O₂和酸性（低pH）的模拟炎症环境中能加速释放NPs，具有良好的ROS和pH响应性。生物相容性实验表明微针提取物无明显的细胞毒性。

EM/Man MNs促进巨噬细胞代谢向线粒体OXPHOS转变并促进M2极化

体外实验表明，EM/Man MNs提取物能有效清除线粒体ROS（mtROS），稳定线粒体膜电位，增加ATP生成。通过细胞能量代谢分析仪检测发现，EM/Man MNs处理显著降低了巨噬细胞的糖酵解水平，同时增强了其OXPHOS能力，表现为基础呼吸、最大呼吸和ATP产生量的增加。免疫荧光和qPCR分析证实，EM/Man MNs促进了巨噬细胞向M2抗炎表型的极化，表现为CD206和IL-10表达上调，iNOS和TNF-α表达下调。

微针贴片的体外血管生成作用

通过划痕实验、Transwell迁移实验和成管实验发现，经EM/Man MNs条件培养基处理的巨噬细胞其分泌的因子能有效刺激人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的迁移和血管生成，CD31免疫荧光强度也显著增强，表明EM/Man MNs具有优异的促血管生成潜力。

微针贴片的体外抗菌特性

平板克隆实验、扫描电镜观察和细菌活死染色结果表明，EM/Man MNs对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均表现出显著的抗菌性能，其抗菌效果优于单纯的微针（MNs）组，EM/Man NPs的加入进一步增强了抗菌能力。

微针贴片对糖尿病感染创面的体内治疗效果

在糖尿病小鼠慢性感染创面模型中，EM/Man MNs治疗组创面闭合加速，残留创面面积显著小于对照组、MN组和EM MN组。体内抗菌实验显示EM/Man MNs能有效清除创面细菌。组织学分析（H&E和Masson染色）显示EM/Man MNs治疗组炎症减轻，肉芽组织形成明显，再上皮化速率最快，胶原沉积更多。CD31免疫荧光显示血管化显著增加。

微针贴片治疗糖尿病慢性创面的转录组测序分析

转录组测序分析揭示，EM/Man MNs治疗上调了线粒体电子传递（细胞色素c至氧气）、线粒体呼吸链复合体IV以及葡萄糖跨膜转运蛋白活性等相关生物学过程。KEGG富集分析显示AMPK通路被上调，而IL-17、NF-κB和TNF等炎症相关信号通路被下调。GSEA结果证实差异表达基因富集于线粒体呼吸链复合体I组装和氧化还原酶活性等通路，表明EM/Man MNs通过恢复线粒体呼吸复合体功能，增强电子传递链活性，驱动代谢从糖酵解向OXPHOS转变，进而减弱炎症信号通路。

微针贴片治疗慢性糖尿病创面的潜在机制

免疫荧光染色显示，与对照组和其他微针组相比，EM/Man MNs治疗组创面组织中AMPK、SIRT1、PGC-1α和线粒体转录因子A（TFAM）的表达显著升高。同时，M2巨噬细胞标志物CD206表达增加，M1标志物iNOS表达减少。流式细胞术和酶联免疫吸附试验（ELISA）进一步证实EM/Man MNs处理降低了促炎细胞因子（TNF-α、IL-6、IL-1β）水平，提高了抗炎细胞因子IL-10水平，M1/M2比率显著降低。表明EM/Man MNs可能通过AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路调控巨噬细胞代谢，促进线粒体生物发生和OXPHOS，从而将巨噬细胞重编程为抗炎表型以促进创面愈合。

体内微针贴片抑制兔耳瘢痕形成

在兔耳增生性瘢痕模型中，EM/Man MNs治疗组瘢痕更平坦，瘢痕厚度显著低于对照组、MN组和EM MN组。瘢痕评估指数（SEI）和温哥华瘢痕评定量表评分均最低。Masson染色和天狼星红染色显示，EM/Man MNs治疗组胶原纤维减少，且III型胶原比例显著增加，I/III型胶原比值最低。转录组测序提示其抑制瘢痕形成的机制可能与下调IL-17和PI3K-Akt信号通路有关。

该研究成功开发了一种可分离核壳微针贴片EM/Man MNs，集快速抗菌、抗炎、促血管生成和抑制瘢痕形成等多种功能于一体，能有效促进糖尿病慢性创面愈合。其作用机制在于：早期应用时，微针利用物理穿透和QACS的抗菌作用快速清除细菌；随后，微针核部在创面高氧化环境下响应性降解，释放出EM/Man NPs；这些NPs通过甘露糖介导的巨噬细胞靶向和EGCG的线粒体靶向作用，级联精准地作用于巨噬细胞线粒体，激活AMPK/SIRT1/PGC-1α信号轴，促进线粒体生物发生和OXPHOS，使巨噬细胞代谢从糖酵解向OXPHOS转变，进而重编程为M2抗炎表型，逆转炎症微环境，协同抑制IL-17和PI3K-Akt信号通路，最终加速创面愈合并减少瘢痕形成。这项研究为通过调控巨噬细胞线粒体代谢进行免疫调节提供了新策略，也为设计用于组织和再生医学的先进生物能量材料提供了新思路。